[发明专利]一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法无效
申请号: | 201210275557.7 | 申请日: | 2012-08-03 |
公开(公告)号: | CN102827919A | 公开(公告)日: | 2012-12-19 |
发明(设计)人: | 张薛;李福志;赵璇;尹倩 | 申请(专利权)人: | 清华大学 |
主分类号: | C12Q1/46 | 分类号: | C12Q1/46;C12Q1/44;C12Q1/34;C12Q1/30;C12Q1/26 |
代理公司: | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人: | 陈波 |
地址: | 100084 北京市*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 水质 物质 大型 慢性 毒性 早期 预警 方法 | ||
技术领域
本发明属于水污染控制技术领域,具体涉及一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法。
背景技术
大型蚤作为国际公认的毒性测试标准生物,其急性毒性和慢性毒性测试已形成国际标准方法,并被广泛应用于农药、化学品、工业废水、生活污水及饮用水水源等的毒性评价。急性毒性通常在24 h或48 h内给出检测结果,但其毒性检出限较高,对于一些毒性物质浓度较低的样品(如城市污水厂二级出水)的响应不灵敏;慢性毒性的检出限较低,相对急性毒性更为灵敏,但其试验耗时较长(21 d),不能及时反映水质状况。因此,需要在现有毒性评价方法的基础上,开发一种快速、灵敏的检测方法,这将对快速检测低毒性水样的水质风险具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述技术的不足提出一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法。
一种水质物质对大型蚤慢性毒性的早期预警方法,此方法针对低毒性水平的水质状况,筛选出大型蚤体内对毒性敏感的标志酶,将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与同样浓度下大型蚤慢性毒性终端指标进行对比,确定与大型蚤慢性毒性终端指标具有线性相关性的标志酶活性指标,形成快速预警水质物质对大型蚤慢性毒性的检测方法,其包含以下具体步骤:
(1)大型蚤的培养及挑选:大型蚤为Daphnia magna, 食物为新鲜培养的绿藻,培养基为曝气脱氯的自来水,培养条件为温度25℃,光照强度10~20 μmol/(m2·s),光暗比为16:8;选取培养3代以上、出生6-24 h的幼蚤;
(2)大型蚤慢性毒性终端指标获得:首先参照OECD202方法进行大型蚤急性毒性的实验,获得水样对大型蚤48h的半数致死浓度LC50;然后在0.01~0.5倍LC50水样浓度范围内设置4-5个浓度梯度,每个浓度设置10个平行,以曝气脱氯的自来水为空白对照,参照OECD 211方法进行21 d大型蚤慢性毒性试验:在20 mL水样或自来水中,放入1只大型蚤,于光暗比为16:8、25℃的培养箱内连续培养21 d,每两天换水喂食一次;每天详细记录大型蚤的生存、怀卵、繁殖情况,并移除幼蚤;实验结束时,以空白对照中大型蚤死亡率不超过10%视为实验有效;在21 d的培养过程中,计算大型蚤的平均首次产蚤时间、平均产幼蚤数量和产幼蚤胎数,与对照组相比,获得实验组中大型蚤生长及繁殖的变化率,得到大型蚤慢性毒性终端指标;
(3)对水质物质敏感的大型蚤标志酶的筛选:以曝气脱氯的自来水为空白对照,根据步骤(2)中得出的半数致死浓度LC50,实验组在0.3~0.5倍LC50水样浓度范围内设置1-2个测试水样浓度,在步骤(2)中相同的培养条件下对大型蚤进行2-7天的短期培养,培养过程中,检测乙酰胆碱酯酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、ATP酶、羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的活性,选择在和对照组中酶活性有显著差异的酶为检测该水质物质的标志酶;
(4)水质物质对短期培养大型蚤标志酶活性的影响试验:按步骤(2)中的浓度梯度,以曝气脱氯的自来水为空白对照,在800 mL水样或自来水中放入120只大型蚤,于光暗比为16:8、25℃的培养箱内培养,每两天换水喂食一次;分别在培养第2、4或7 d收集实验组和对照组的大型蚤各30只,采用标准方法或商用试剂盒测定步骤(3)中选择的标志酶活性;与对照组相比,计算实验组中大型蚤标志酶活性变化率;
(5)数据相关性分析:将在相同浓度的水样下,将短期培养的大型蚤标志酶活性变化率与21天培养的大型蚤慢性毒性终端指标生长或繁殖的变化率进行线性拟合,确定两者是否具有相关性。
所述低毒性水平对大型蚤急性毒性测试无明显响应的毒性水平。
所述短期培养为2-7天。
其中大型蚤的食物绿藻的培养和收集为:绿藻采用SE或BG11培养基,置于温度25℃、光照强度40~60 μmol/(m2·s)、光照比14:10的人工气候箱中培养,培养7-10 d,离心收集藻细胞,用于喂食大型蚤。
大型蚤体内标志酶提取和活性检测方法为:将大型蚤依次用高纯水和0.05 mol/L Tris-HCl(pH=7.5)缓冲溶液清洗后放入玻璃匀浆器中,在冰浴中加入1 mL Tris-HCl缓冲溶液和10μL苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)充分匀浆,匀浆液在4℃、8000 rpm条件下离心15 min,取上清液并保持在冰浴环境下,采用标准方法或商用试剂盒测定标志酶活性。
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