[发明专利]一种构建TALE重复序列的方法

权利要求书

1.用于构建TALE重复序列的旁单元，其为两端含有同尾酶或不同的平末端酶识别位点的重复单元DNA片段，所述的重复旁单元的DNA片段编码含有NI、NG、HD、NK或NN的重复可变二残基RVD的重复氨基酸单元或其变体，其中，在5’端同尾酶或平末端酶的识别位点中，识别位点的3’端至少有1个核苷酸参与编码旁单元N端的氨基酸；在3’端同尾酶或平末端酶的识别位点中，识别位点的5’端至少有1个核苷酸参与编码旁单元C端的氨基酸。

2.根据权利要求1所述的旁单元，其特征在于，所述的同尾酶切割后同尾相连或平末端酶切割后平末端连接后的旁单元不改变重复单元氨基酸的编码。

3.根据权利要求1所述的旁单元，其特征在于，所述的重复单元DNA片段编码典型的天然TALE重复单元中存在的+11位氨基酸残基Ser起至下一重复单元+10位氨基酸残基Ala为止之间的氨基酸序列，所述的同尾酶为SpeI和NheI。

4.根据权利要求3所述的旁单元，其特征在于，所述的旁单元编码的重复单元的氨基酸序列如SEQ ID No.1~15任一所示。

5.根据权利要求3所述的旁单元，其特征在于，所述的旁单元的核苷酸序列如SEQID No.16~30任一所示。

6.含有权利要求1~5任一项所述的旁单元的单一旁单元载体。

7.根据权利要求6所述的单一旁单元载体，其特征在于，其中同尾酶或平末端酶识别位点的外侧还含有其它的内切酶识别位点，所述的内切酶识别位点不含于旁单元序列中，并且不同于所述的同尾酶或平末端酶识别位点。

8.根据权利要求7所述的单一旁单元载体，其特征在于，所述的其它的内切酶识别位点为Hind III识别位点。

9.含有任意重复数的权利要求1~5任一项所述的旁单元的旁单元串联重复序列。

10.含有权利要求9所述旁单元串联重复序列的旁单元串联重复载体。

11.含有权利要求9所述的旁单元串联重复序列的编码人工TALE蛋白DNA结合结构域及其衍生的各种融合蛋白的载体。

12.根据权利要求9所述的载体，其特征在于，还含有天然TALE蛋白的N端和C端非重复序列区的部分或全部编码序列及部分重复单元的编码序列及其变体。

13.权利要求9所述的旁单元串联重复序列的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）用所述的同尾酶分别切割任意旁单元，再将切割的任意旁单元通过粘末端相连，获得头尾相接、串联排列的双旁单元；

2）重复采用步骤1）所述的酶切－连接的操作组装成含有任意重复单元数、任意排列顺序的旁单元串联重复序列；或

1）用所述的平末端酶分别切割任意旁单元，再将切割的任意旁单元平末端相连，获得头尾相接、串联排列的双旁单元；

2）重复采用步骤1）所述的酶切－连接的操作组装成含有任意重复单元数、任意排列顺序的旁单元串联重复序列。

14.权利要求10所述的旁单元串联重复载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）用所述的互为同尾酶中的一个和所述的内切酶切割任意一个单一旁单元载体，用所述的互为同尾酶中的另一个和所述的内切酶切割任意另一个单一旁单元载体，再将两者含有旁单元的酶切产物进行连接，获得双旁单元载体，该载体含有头尾相接、串联排列的两个旁单元；

2）重复采用步骤1）所述的酶切－连接的操作组装成含有任意重复单元数、任意排列顺序的旁单元串联重复载体；或

1）用其中一个平末端酶和所述的内切酶切割任意一个单一旁单元载体，用其中另一个平末端酶和所述的内切酶切割任意另一个单一旁单元载体，再将两者含有旁单元的酶切产物进行连接，获得双旁单元载体，该载体含有头尾相接、串联排列的两个旁单元；

2）重复采用步骤1）所述的酶切－连接的操作组装成含有任意重复单元数、任意排列顺序的旁单元串联重复载体。