[发明专利]一种微生物谷胺酰转氨酶的分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的分离纯化方法，具体涉及一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法。

背景技术

谷氨酰胺转胺酶（Transglutaminase，简称TG，EC2.3.2.13；又称蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转胺酶）是一种催化酰基转移反应的酶。TG可作为酰基受体与蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基作用，形成ε-（γ-谷氨酰）Lys键，从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，进而改变蛋白质功能性质，提高蛋白质的营养价值，在食品、生物制药、纺织等领域有广泛的应用。谷氨酰胺转胺酶广泛存在于动物、植物和微生物中，包括源自动物的谷氨酰胺转胺酶（Guinea-pig Transglutaminase，GTG）和源自微生物的谷氨酰胺转胺酶（Microbial Transglutaminase，MTG）。GTG主要从动物组织中提取，但是由于其分离纯化过程复杂、来源较少、价格昂贵，极大地限制其在工业生产上的应用。

与GTG相比，MTG在应用上具有对Ca²⁺的非依赖性，对热、pH的稳定性以及易储藏性等优点。研究表明MTG具有与GTG类似的作用和功能，比如MTG可以催化I型胶原蛋白发生交联，形成耐高温的胶（Nomura Y, et.al; Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Apr;65(4):982-5）；可以交联明胶，形成良好的多孔网状物用于止血和伤口粘合（Liu Y, et.al, J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2009 Oct;91(1):5-16；中国专利：200780051215.4、200980131973.6；美国专利:8133484；欧洲专利：WO2012017415、EP2303344)； MTG与明胶作用形成的交联物不易受热溶解，具有较好的热稳定性（Chen T, Embree HD, et.al ; Biomaterials. 2003 Aug;24(17):2831-41，美国专利：5,834,232）等，因此微生物谷氨酰胺转胺酶可作为潜在医用止血材料的交联剂用于止血、伤口粘合等外科手术中。但是，目前市场上的MTG主要用于食品加工领域，且采用传统分离纯化工艺制备，制备过程中酶的得率、纯度以及比活力都不高，仍含有多种杂蛋白，难以满足作为医用材料的要求。

发明内容

本发明克服现有技术的上述缺陷，创新提出了一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，即利用分散酶在室温条件下对链霉菌发酵液中的pro-MTG（MTG的前体形式）进行水解处理后得到具有活性的MTG，然后，经乙醇沉淀，结合阴、阳离子交换层析对MTG进行纯化，在提高的同时，得到了高纯度（>95%）和酶比活力（>20000U/g）的MTG，且提高了活性MTG得率。本发明方法分离纯化得到的微生物谷胺酰胺转胺酶符合医用材料的要求，能够用于医用止血材料和粘合剂。

本发明旨在提供一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，从茂源链霉菌突变菌株发酵液中获取高纯度的MTG，用作医用止血材料和粘合剂原料。本发明中，源自微生物的谷氨酰胺转胺酶（即MTG）属胞外酶，主要来源于微生物中的链霉菌，如吸水链霉菌、茂源链霉菌等，其分子量大小在38KD左右，酶的活性中心包含有一个游离的Cys巯基。

本发明提出的一种微生物谷氨酰胺转胺酶的分离纯化方法，包括，在链霉菌发酵液中加入50-200mg/L的分散酶处理；然后，经乙醇沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析，再经脱盐、浓缩、过滤、冻干后得到所述微生物谷氨酰胺转胺酶；其中，所述微生物谷氨酰胺转胺酶的纯度大于95%，比活力为20000-50000U/g。

其中，所述链霉菌发酵液为茂源链霉菌STK4突变菌株发酵液；所述微生物谷胺酰胺转胺酶的第10位氨基酸为丝氨酸或苏氨酸；第241位氨基酸为丙氨酸或甘氨酸；第284位氨基酸为缬氨酸或者酪氨酸。

本发明中，“链霉菌发酵液”是指茂源链霉菌STK4菌株在发酵培养基中培养48-72小时后的发酵液。

本发明中，“茂源链霉菌STK4突变菌株”是指茂源链霉菌STK4野生菌株经紫外辐照诱变后产生的MTG突变菌株。

本发明中，所述阴离子交换层析步骤中，上样缓冲液为pH7.0- 7.5的Tris-HCl缓冲液；洗脱液为0-2mol/L的NaCl溶液。