[发明专利]一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖

说明书

技术领域

本发明涉及一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖，以及其应用。 

背景技术

随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，污水的排放量迅速增加，处理污水成为当前社会的难题之一。利用细菌处理污水是目前的热门研究，但尚无一种较为理想的菌种。 

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一株可以用于污水处理的海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ及其产生的多糖，以及其应用。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

一株海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ，该菌株已于2011年12月09日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011456。 

该菌株的特征为：Pseudoalteromonas issachenkonii HZ为革兰氏阴性菌，短杆状，在Zobell 2216E固体培养基菌落大（直径3mm），乳黄色，圆形，隆起，边缘较圆整，不透明，无迁移性。 

本发明的菌株是通过以下方式筛选得到的：样品采集自山东荣成海域，取样时间为鲍鱼苗期幼体从附着基剥离时（5月中旬）。样品为刮取的板上10cm²面积上的附着物，存放在2ml灭菌冻存管中，密闭保存在冰盒中，24小时内送回实验室。进行异养菌的分离和DNA的提取。将采集的样品用无菌海水稀释为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个浓度，用灭菌的涂布器均匀涂布于2216E固体培养基平板上，25℃恒温培养48h，挑取形态差别显著的的菌落。用划线法进行纯化。通过苯酚-硫酸法对所得菌株是否产多糖进行检测，初筛多糖产量超过0.5g/L，得到该产多糖菌株，通过DNA序列分析确定了其种属关系，属于Pseudoalteromonas。 

一种多糖，是由培养海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ所得到的，具体如下： 

（1）培养：海洋细菌Pseudoalteromonas issachenkonii HZ菌株经斜面培养、种子培养后得到种子培养液，接种到发酵培养基中，接种量2%～5%（体积百分数），温度20～35℃，150～250r/min摇床培养30～40h，得发酵液； 

（2）提取：发酵液5000rpm/min离心20min，过滤去除菌体，向上清液中加入3倍体积的95%乙醇（体积百分数），静置8～12h，离心得到沉淀，即为蛋白质和多糖的混合物； 

（3）除杂蛋白：将上述得到的蛋白质和多糖的混合物溶于水中，加入总体积1/4体积的Sevag溶剂（氯仿：正丁醇=4：1，体积比），充分震荡10min，离心去除有机相；重复进行8次，得到粗多糖溶液； 

（4）分离纯化：采用DEAE-52对粗多糖进行分级，用0-2M NaCl Tris-HCl（0.01M）进行梯度洗脱，收集主峰；将收集到的主峰浓缩脱盐、冷冻干燥后，溶于0.1M NaCl溶液，用Sephadex G100层析，用0.1M NaCl洗脱，收集第一个洗脱峰，冷冻干燥后即得到多糖，命名为EPS-1。 

所述斜面培养、种子培养对所属领域技术人员而言是常规的技术操作，在此不再赘述。 

所述培养所用的斜面培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，琼脂20.0g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述培养所用种子培养基为：Zobell 2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，磷酸铁0.01g，陈海水1000ml，调ph至7.6～7.8。 

所述发酵培养基为：牛肉膏0.25%，蔗糖3%，海盐（硝酸铵0.00016％，硼酸0.0022％，氯化钙0.18％，磷酸氢二钠0.0008％，柠檬酸铁0.01％，氯化镁0.88％，溴化钾0.008％，氯化钾0.055％，碳酸氢钠0.016％，氯化钠1.945％，硅酸钠0.0004％，硫酸钠0.0324％，氯化锶0.0034％，氟化钠0.00024％），余量为水，pH7.6～7.8。所述百分数均为质量百分数。 

所述培养条件为：温度30℃，200r/min摇床培养36h，此条件下，多糖产量可达到2.76g/L。