[发明专利]一种家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法

权利要求书

1.一种家蚕天然膜蛋白PRMC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述的家蚕天然膜蛋白PRMC2的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备家蚕生物膜组分；

(2)利用去垢剂提取家蚕天然膜蛋白PRMC2；

(3)分级纯化所述家蚕天然膜蛋白PRMC2。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：将保存于-80℃的蚕蛹粉与4℃预冷的灭菌ddH₂O等体积混合匀浆2 min，停2 min，置于冰上冷却，重复9次；8000 rpm、4℃离心60min，重复3次；上清于15000 rpm、4℃离心60 min，重复3次，最后一次4层纱布过滤；过滤上清液进行0.1μm膜包超滤，其中料液体积比为1:1，重复10次，体积恢复到过滤前体积；上清液于50000rpm，10℃离心40分钟；上清密度梯度离心；铺制蔗糖密度：PB (150ml)，样品(350ml)，30wt %(400ml)，40wt %(400ml)，55%充满，30000rpm密度梯度离心3 h；用56%蔗糖溶液下样，按30ml/管收集，取样3ml，做比活测定；将区带离心后收集的样品进行测活；将活性高的膜组分混合，分别用超滤液100kD膜包超滤10次脱糖。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：将脱好糖的细胞膜组分与膜蛋白提取液按体积比1:2的比例混合，4℃轻微搅拌过夜至少8小时；将提取好的膜蛋白混合液于8000 rpm离心20分钟后取上清，准备装柱过阴离子交换。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括：将准备好的蛋白样品600ml在4℃与280mlDEAE填料缓慢均匀搅拌混合，每隔10分钟搅拌一次，共混合2小时，每次装柱前都应将填料搅拌均匀，同时将柱子下方出样口打开，并收集流出液，直到柱子全部装好；将装好的DEAE柱连接到AKTA液相色谱仪上后，用20mMTris平衡600ml,平衡好后，用梯度提高NaCl浓度的方法进行分布洗脱，共出现4个大峰，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用SuperdexTM 200进一步分离，并对每个峰走电泳检测；将含有目的蛋白的峰收集浓缩，用RESCOURCE Q，1 mL进一步梯度洗脱分离，共分得7个峰，并对每个峰走电泳检测，以获得较纯的家蚕天然膜蛋白PRMC2。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述膜蛋白提取液含有1%的去垢剂CHAPS。