[发明专利]一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，采用的发酵菌株是2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高产漆酶的密孔菌属菌株，该发明的特点是以被列为世界十大害草之一的水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，用DMP法测酶活，漆酶活力为73.61U/g干基，成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、废水处理等领域，属于生物技术领域。 

背景技术

漆酶是一种木质素降解酶，它能够催化木质素或与木质素结构类似的芳烃类和酚类化合物的降解，因此在木质素类环境污染物的降解与利用方面具有一定的应用潜力和价值。 

凤眼莲俗称水葫芦，原产南美，1901年被引入中国，因其叶下有一个直立的葫芦状茎而得名。水葫芦繁殖能力很强，其大规模化生长直接影响其它水生植物和动物的生长，破坏水体的生态平衡，因此已被列为世界十大害草之一。由于近几十年我国工业化的快速发展，使得江河湖水严重富营养化，造成水葫芦泛滥成灾，其中最严重的地区有滇池，还有太湖流域等。据统计，每年为了治理水葫芦的污染，政府要花费数亿元的捕捞费。因此，如何有效地治理水葫芦，成为亟待解决的问题。目前解决水葫芦问题的途径主要有化学、物理和生物防治以及综合利用。综合利用被认为是其中最好的解决方法，其出发点是提高水葫芦的综合利用价值，只有资源的利用率提高，污染才会随之降低。这促使我们去探索研究怎样变废为宝、产生附加值更高的产物，既达到水葫芦综合 利用的目的，又带来更高的经济价值，本发明就是在这样的指导思想下，经过试验获得成功的。 

发明内容

本发明用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)的保藏编号为：CCTCC M2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，研究出以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵产漆酶的方法，既达到水葫芦综合利用的目的，又创造出更高的经济价值产品漆酶，并且生产制备成本低廉且可变废为宝，简便易行。所产漆酶可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、废水处理等领域，属于生物技术领域。 

本发明的技术方案：用2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3产漆酶的密孔菌属的野生菌株为生产出发菌株，经种子培养和是以水葫芦和木屑为主要原料固态发酵生产制备漆酶，工艺为： 

(1)种子培养 

种子培养基：20g/L葡萄糖，200g/L马铃薯。 

马铃薯需切成片或块，加水煮20-30分钟，用纱布过滤取其汁。 

接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为0.5CM的菌落接入装有50ml种子培养基的500ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10-20粒，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液。 

(2)发酵产酶培养基 

将木屑也60℃烘箱中烘干至恒重；水葫芦晾晒，60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎成丝状；称水葫芦20g，木屑11g放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢 氧化钠调PH＝3.5的水60ml，再加入CuSO₄·5H₂O 1.5mmol/L，没食子酸40μmol/L，121℃灭菌20分钟，冷却后待用。 

(3)发酵产酶及酶液提取 

灭菌冷却后在发酵产酶培养基中加入20ml种子培养液并充分与木屑和水葫芦混合，并用8层纱布封口置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30℃、200rpm条件下继续培养2小时，然后在30°环境中静止15小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去固型物和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除木屑和水葫芦的重量，得到干物质产漆酶的单位U/g. 

(4)酶活的测定方法