[发明专利]一种生产正己醇工程菌的构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地，本发明涉及一种生产正己醇工程菌的构建方法。

背景技术：

正己醇是一种重要的医药、农药和香料中间体。近年来研究发现它也是一种理想的液体生物燃料，其燃烧热12402千卡/kg，比0#柴油的燃烧热9600千卡/kg高2805千卡/kg，是未来柴油的优良替代品，可以替代矿物燃料。工业正己醇的合成通常是采用乙烯催化控制聚合后，再水解、分离而得，还可由正己酸乙酯还原而得。

目前已能利用生物发酵法制备乙醇、正丁醇、1,3-丙二醇等低碳醇，但是利用生物发酵法制备正己醇的技术还比较少见。美国齐凯姆公司发明了一种间接制备正丁醇和正己醇的方法，在包含碳水化合物源的培养基中进行同型产乙酸发酵得到乙酸酯、乙酸及其混合物，将其中一部分化学转化为乙醇，一部分和乙醇培养基中产酸发酵制备丁酸酯、丁酸、己酸酯、己酸或其混合物，再将其化学转化为丁醇和己醇。采用该方法，可以有70％的碳源转化为了丁醇和己醇，但是该方法操作过程繁琐，且正己醇选择性并不高（丹·W·沃瑟，CN200980112342.X）。本地生物，如Clostridium Kluyveri，已报道发酵乙醇和醋酸纤维素，不仅产生丁酸、己酸、H2，还产生正丁醇和正己醇，但是，并没有对生物合成正己醇的酶进行定义。张等报道了正己醇合成，通过延伸Atsumi等开发的2-酮酸合成路径，大肠杆菌催化从葡萄糖合成正己醇。Liao研究小组等人通过设计具有NAPH和乙酰CoA驱动力的正丁醇人工途径，获得新型大肠杆菌合成细胞工厂，正丁醇产量可达30g/L。美国科学家通过引入六碳化合物的合成酶Bktb（?-ketothiolase），延长改造正丁醇人工合成路径，开发出一种新型的正己醇合成细胞工厂，即乙酰辅酶A工程菌正丁醇路径合成正己醇，大肠杆菌工程菌催化，从葡萄糖直接合成正己醇，并初步研究了己醇合成酶及其影响因素（Yasumasa Dekishima,Ethan I. Lan,Claire R. Shen,et.al, Journal of the American Chemical Society, 2011,133:11399-11401）。但是目前由于Bktb酶活不高造成正己醇合成途径碳流较低，使得合成细胞工厂产物仍以正丁醇为主。后期计划通过定向改造Bktb，提高胞内己醇前体物酮基己酰CoA和可用NADH的量来进一步增加正己醇的生产。

过去一直没有微生物能由葡萄糖合成高级醇类，现在研究人员已能通过基因工程手段对大肠杆菌进行改造，使其能够从葡萄糖合成长链醇类，包括异丁醇、2-甲基-1-丁醇或3-甲基-1-丁醇。我们认为，可以通过选择性地操纵基因，设计微生物，以合成许多不同的燃料和化学品。本发明利用基因工程方法，将梭菌属Fe-氢酶基因hydA（GenBank 登录号：EU590683）和地衣芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因lic（GenBank登录号：AY225317）的重组基因hyd-lic插入大肠杆菌构建了正己醇合成工程菌。

发明内容：

本发明提供了一种生产正己醇工程菌的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案如下：

设计引物，pUC19-hydA质粒和pUCm-T-lic质粒分别PCR扩增，在连接酶作用下连接成为重组DNA的基因hyd-lic，

hyd-lic连接到载体pTE28aT7，得到质粒pTE28aT7-hyd-lic，

质粒pTE28aT7-hyd-lic转化至宿主菌P. pastoris kM71感受态细胞中，利用YPD/G418平板筛选高拷贝转化子，摇瓶发酵。比色测定法测定酶活。

工程菌生产正己醇活性检测：收集重组菌发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验产己醇活性如下:用pH3～8的醋酸缓冲液配制20%～60%的纤维素半水解物溶液，适量粗酶液，37℃反应24h，再55℃反应12h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物。     本发明制备的工程菌应用于正己醇发酵，检测到了正己醇的生成，工程菌酶活达83U/mL，发酵产物正己醇含量最高可达35g/L。

具体实施方式：

下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。

实施例1、生产正己醇工程菌的制备