[发明专利]一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是：所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述支撑层用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成；样品吸附纤维层用玻璃棉、尼龙纤维或聚酯纤维制成；金标抗体纤维层用玻璃棉制成。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纤维素膜、羧甲基纤维素膜或聚偏二氟乙烯PVDF纤维素膜制成；所述吸水材料层用吸水纸制成。

4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述纤维素膜层上含有一条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜”、“十十”、“┬ ┬”、“┴ ┴”、“├├”、“┤┤”和“● ●”中的任一种；纤维素膜层上含有两条/个检测印迹时，检测印迹、对照印迹的排列形式为“｜｜｜”、“十十十”、“┬ ┬ ┬”、“┴ ┴ ┴”、“├├├”、“┤┤┤”和“● ● ●”中的任一种。

5.根据权利要求1～4任一项所述的试纸条，其特征是：在所述样品吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品吸附纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线。

6.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征是：该方法包括以下步骤：

（1）大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的制备；

（2）胶体金标记的葡萄球菌蛋白A的制备：以柠檬酸钠还原法制备胶体金，进而获得胶体金标记的SPA；

（3）羊抗或兔抗SPA的IgG抗体的制备：

用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种分别在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制成对照印迹；将胶体金标记的葡萄球菌蛋白A用于制备金标抗体纤维层，然后将支撑层、吸附层和保护层依次组装成试纸条。

7.根据权利要求6所述试纸条的制备方法，其特征是：其中大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原的制备方法如下：

根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物：上游引物5’ATAGGATCCA

TGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’ 引入酶切位点BamHI，下游引物5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位点HindIII；以重组质粒pMD18T-VP1 为模板，进行PCR 扩增，获得VP1 基因；PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中，转化大肠杆菌，将重组菌在LB培养基中培养至OD600 达到0.6 时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其浓度为0.5mmol/L，在37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；

将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。