[发明专利]一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及肝癌转移复发的诊断与治疗技术领域，具体涉及一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子及其应用，可用于肝癌转移复发的靶向诊疗。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，占全部恶性肿瘤的6%，中国是世界上肝癌死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%，在中国已成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5%左右。目前，临床主要依靠定期复查甲胎蛋白AFP等血清学标志物和B超等影像学检查来发现术后的转移复发，但AFP阳性的肝癌只有70%-80%，B超无法发现小于1cm的肝癌，诊断均存在盲区，不能准确及时预测。因此进行筛选HCC转移相关的靶分子用来预测并干预转移复发的研究尤为重要。

近年来发展起来的SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子（aptamers），已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，具有良好的应用前景。

特异结合于肿瘤细胞的核酸适配子有利于肿瘤的诊断和治疗。抗体可以特异识别肿瘤细胞的标志物，但缺点是分子大且具有免疫原性。人源化抗体等抗体工程技术更具前景，但因易被肽酶降解和有免疫反应而导致应用受限。适配子出现十多年来，已可应用于酶链寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。适配子可以作为肿瘤发生和发展过程中具有重要功能的蛋白质的直接抑制剂。

然而到目前为止，还没有出现成功将SELEX筛选技术用于开发诊断及治疗肝癌转移复发的试剂的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种能特异性地、高亲和力地结合高转移潜能肝癌细胞HCCLM9（Wu et al.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research 2010,29:17,http://www.jeccr.com/content/29/1/17）膜表面的单链DNA适配子；

本发明的第二个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联荧光量子点形成的功能化生物分子探针，能识别组织切片中的肝癌细胞；

本发明的第三个目的在于提供一种上述单链DNA适配子耦联磁性颗粒的复合物，能捕获外周血模拟环境中的循环肝癌细胞；

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备肝癌靶向诊断试剂中的应用。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备靶向性抗肝癌转移复发药物或抗肝癌转移复发药物靶向输送载体中的应用。

为了实现上述诸目的，本发明采用了以下技术方案：

一种靶向人高转移肝癌细胞的单链DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其筛选及初步的应用研究过程如下：

①随机ssDNA文库的构建和引物的合成

构建长度为76nt的随机文库，两端为固定序列，中间为40个核苷酸随机序列，库容量大约为10¹⁵-10¹⁶，根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。ssDNA文库的序列：5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-（N40）-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3’，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基；上游引物P1:5’-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3’；下游引物P2：5’-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3’；

②SELEX筛选过程