[发明专利]一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼类精巢生物反应器的制备方法，还涉及一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用蛋白质、工业酶、疫苗和抗体中的应用。 

背景技术

转基因生物反应器是指将外源基因转入细胞或动植物、微生物，利用细胞增殖或生物体代谢制备外源基因的表达产物，主要包括转基因微生物生物反应器、转基因动物生物反应器和转基因植物生物反应器三大类。 

转基因微生物生物反应器生产的产物一般不具备生物活性，须经过后续的糖基化、羟基化等一系列修饰加工，工艺繁琐，耗时费力。转基因动植物生物反应器的产物具有天然的生物活性，产品无需后加工过程，受到研究者们的青睐和社会各界的关注。 

就转基因动物生物反应器而言，最令人瞩目的是转基因动物乳腺生物反应器。利用乳腺反应器生产的重组人抗凝血酶Ⅲ是第一个获准上市的动物生物反应器蛋白药物（GTC Bio-therapeutics.Inc.http://www.transgenics.com/pressre-leases/pr060206.html）；转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器生产的重组蛋白已进入临床Ⅲ期试验；数百种重组蛋白处于研发阶段。由于转基因动物乳腺生物反应器的主体是哺乳动物，有限的卵细胞数量和胚胎的体内发育使得转基因操作极其困难，加上扩群速度缓慢，产品难以实现快速规模化生产。 

鱼类转基因技术成熟，受精和胚胎发育过程在体外进行，易于转基因操作和筛选目的基因高表达的个体，以建立多途高效生物反应器平台；红鲤怀卵量大，性成熟的雌鱼每尾可产卵5万颗以上，具有扩群速度快的特点；红鲤生长快，雄性个体在南方地区一年即可性成熟，精液平均产量10-20ml/尾/次，总蛋白含量为3.04mg/ml；在人工控制环境下，红鲤可多季节，甚至常年生产精液，按每亩水面养殖1000尾雄鱼，每半个月生产一批次精液，平均每尾产精液10ml计算，年产精液可高达240,000ml。鱼类精巢生物反应器具有研制快捷、规模化迅速的特点，适合生产中低需求量的蛋白质产品，应对瞬息万变的市场需求。鱼类精巢生物反应器将成为生物反应器家族中一个重要的成员。 

禽流感（Avian influenza,AI），又称真性鸡瘟，是由A型流感病毒引起的禽类的一种急性、高度致死性传染病。禽流感根据病原体表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）分成若干亚型，目前已经发现15种血凝素亚型(Hl～H15)和有9种神经氨酸酶亚型(N1～N9)，H 5N1属于高致病性的一种亚型。高致病性禽流感病毒不仅可感染家禽，而且能突破种属屏障，感染人类，禽流感被国际兽医局定为A类传染病，我国将其列为一类动物疫病，禽流感的预防和控制是关乎禽类养殖业发展和人类健康的重大课题。 

目前，用于预防和控制病毒性流行病的疫苗主要包括全病毒灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗。全病毒灭活疫苗的生产存在安全隐患，可能对环境和生产人员健康构成威胁；减毒活疫苗研发困难，且存在毒力恢复、形成新流感毒株的潜在的风险。传统亚单位疫苗从病毒粒子中分离获得，虽安全性得到保障，但生化制备工艺复杂、成本高昂，难以推广应用。随着基因克隆、DNA重组和转基因技术的发展，利用真核表达系统生产廉价的目标蛋白成为可能，藉此生产的亚单位疫苗同时具备良好的免疫原性和高度的安全性，是目前该领域研究的热点。 

本发明利用红鲤精巢作为生物反应器，制备禽流感病毒H5N1表面抗原--血凝素蛋白，建立一个H5N1亚单位疫苗的生产平台。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鲤鱼精巢生物反应器的制备方法，方法易行，操作简便。鲤鱼精巢生物反应器是一种以转基红鲤为宿主动物、红鲤精巢为产物特异表达组织的生物反应器，该生物反应器具有研制快捷、规模化迅速的特点，适合生产中低需求量的蛋白质产品，可应对瞬息万变的市场需求。 

本发明的另一个目的是在于提供了一种鲤鱼精巢生物反应器在制备药用蛋白质、工业酶、疫苗和抗体中的应用，通过将两个鱼类精巢特异高效表达启动子分别与目的蛋白基因进行重组，通过显微注射方法，将重组基因导入红鲤受精卵，使其在基因组中稳定整合，从而在精液中获得目的蛋白，可实现对目的蛋白的规模化生产。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施： 

一种鲤鱼精巢生物反应器，通过以下步骤制备得到：