[发明专利]一种用于检测酶活性的荧光小分子探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测酶活性的荧光小分子探针及其制备方法和应用。 

背景技术

苝（perylene）是一种具有平面芳香结构，由五个苯环稠合而成的有机染料分子，具有优良的荧光量子效率和光，热稳定性。苝分子容易在溶液中聚集而使荧光淬灭并且具有较低的背景，而当其解聚集后产生的是荧光增强的正信号。 

酶（enzyme）是产生于生物体内活细胞的一种生物催化剂，能在机体中十分温和的条件下，高效率地催化各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖等都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。对于特定酶活性及其抑制剂的检测在生物技术，生物化学以及临床诊断等领域有着重要意义。 

目前报道的用于酶活性检测的手段有许多种，例如纳米粒子比色，电化学，化学发光，色谱法等。其中，基于荧光的检测方法由其简便，灵敏，快速的优势而受到人们的日益关注。AIE（aggregation-induced emission，聚集诱导发光）是一种特殊的荧光现象，具有这种现象的分子在单体状态并不发光，而是在外界诱导集聚的时候发出较强荧光。利用这种性质发展了许多检测酶活性的新方法。例如2010年，Bao-Hang Han等人（Glucosamine hydrochloride functionalized tetraphenylethylene:A novel fluorescent probe for alkaline phosphatase based on the aggregation-induced emission.Chem.Commum.2010，46，4067），利用具有AIE性质的四苯乙烯分子和磷酸酶底物的静电作用而产生的荧光变化，报道了对于碱性磷酸酶活性的检测。但这种方法给出的是荧光减弱的负信号（探针与底物聚集发光，酶作用后解聚集荧光淬灭），而在检测体系中使荧光减弱的干扰因素很多，这样就影响到了检测的灵敏度和精确性。此外，目前已见报道的检测酶 活性的方法，多存在着稳定性差，步骤繁琐，成本高等缺点，有待于进一步改进。 

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的检测酶活性方法许多是给出荧光减弱的负信号，而导致检测的灵敏度低、稳定性差、步骤繁琐和成本高的问题，而提供一种用于检测酶活性的荧光小分子探针及其制备方法和应用。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下： 

本发明提供一种用于检测酶活性的小分子探针，该小分子探针为3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝（3,4,9,10-tetra-(4-trimethylammoniobutyloxy-carbonyl)-perylene），其结构式为： 

本发明提供一种用于检测酶活性的小分子探针的制备方法，包括如下步骤： 

步骤一：将苝酐溶于碱溶液中，过滤，滤液调节pH值至8～9，加入四正辛基溴化胺和1，4-二溴丁烷，在100℃～120℃回流反应1～3h，经萃取、蒸馏和纯化，得到化合物3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝；所述的苝酐、四正辛基溴化胺和1，4-二溴丁烷的摩尔比为1∶0.1∶10； 

步骤二：将步骤一的得到的化合物3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝溶于溶于四氢呋喃与水的混合液中，在混合溶液中加入三甲胺，在60℃～70℃回流48～96h，经蒸馏、萃取和干燥后得到3,4,9,10-四-（4-三甲基胺丁基氧-羰基）-苝，所述的3,4,9,10-四-（4-溴丁基-酯基）-苝与三甲胺的摩尔比为1∶20。 

本发明还提供一种用于检测酶活性的小分子探针的应用，该小分子探针可用于检测酶的活性，其检测方法为：将小分子探针和底物分子配置成混合溶液，再混合溶液中加入不同浓度的酶，对酶的活性进行荧光检测。 

优选的是，所述的底物分子为ATP、多肽或核酸分子。 

优选的是，所述的酶为磷酸酶、蛋白酶或核酸酶。 

优选的是，所述的检测反应体系为：400μL总体系，浓度为5mM pH值为8.2的Tris-HAc缓冲溶液，浓度为1-5μM小分子探针，浓度为0.2-200μM底物分子，0-5U/mL的酶，余量为无菌水。 

优选的是，所述的检测温度为25℃。 

优选的是，所述的荧光检测条件为以442nm荧光激发，450－650nm荧光检测。