[发明专利]用普鲁士蓝平板定量测定L-氨基酸氧化酶活力的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及L-氨基酸氧化酶活力测试方法，特别涉及一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法。 

（二）背景技术

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase,简称LAAO，酶学编号为：EC1.4.3.2)是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或单核苷酸(FMN)为辅基的黄素蛋白酶。此酶能够特异性催化L-氨基酸的氧化脱氨生成α-酮酸、氨和过氧化氢。因此，它能被应用于L-氨基酸定量分析、LD-氨基酸的拆分和α-酮酸的制备。近年来有文献报道了LAAO本身具有抗菌、杀虫、抗病毒等生物活性，还具有与血小板相互作用、细胞毒性及诱导细胞凋亡的作用，其在生物医药领域具有极其广阔的应用前景。 

LAAO被发现广泛存在于微生物、蛇毒、鱼的表皮粘液、老鼠、海兔子等多种生物体中。目前检测LAAO活性的常用方法有2种，即荧光法和分光光度法。这2种方法均是依据测定由LAAO催化底物所生成的H₂O₂变化量来实现的。荧光法是依据酶促反应产生的H₂O₂可使无荧光性的高香草酸等物质转变为有强烈荧光的物质，根据反应体系荧光值的变化来测定LAAO酶活。此方法虽然测定精确度、灵敏度都较高，但荧光寿命短，容易淬灭，操作时需避免长时间暴露于光和空气中，而且蛋白质中某些氨基酸对其干扰较大。分光光度法是依据酶促反应产生的H₂O₂可作用于色素原物质而使其在一定波长下产生吸光值，根据反应体系吸光值的变化来测定LAAO酶活。此方法对设备要求低，反应快，操作简单，重复性好，且价格便宜，具有明显的优势，因此分光光度法是目前测定LAAO活性的最常用方法。MacHeroux等（MacHeroux P,Seth O,Bollschweiler C,et al. L-Amino acid oxidase from the Malayan pit viper Calloselasma rhodostoma.Comparative sequence analysis and charaterization of active and inactive forms ofthe enzyme.Eur J Biochem,2001,268:1679-1686.）以邻联茴香胺（ODA）为偶联探针，用分光光度法测定不同蛇毒LAAO的活性。结果表明，测定方法具有较好的稳定性。陈洲等（陈洲,黄剑钧,薛玲,等.眼镜蛇毒L-氨基酸氧化酶活性检测方法的优化.海峡药学,2009,21(5):29-31.）采用邻联茴香胺、邻苯二胺(OPD)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)三种供氢体测定LAAO的活性并比较其灵敏度和重复性，结果表明邻苯二胺方法测定LAAO酶活性具有较好的灵敏度和稳定性。以上的这些方法主要是用来定性地检测LAAO，而建立一种既简单、经济、稳定和灵敏，又能定性并定量检测LAAO活力的方法，将具有极重要的研究和应用价值。目前，定性及定量检测LAAO的方法主要是商品化的H₂O₂检测试剂盒，如美国Invitrogen公司的Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit。发明专利（余志良、乔华、裘娟萍.交替假单胞菌B3及其在生物氧化L-氨基酸中的应用.申请号：201110336029.3；申请日期：2011-10-28.）也用Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay kit试剂盒筛选到一株产LAAO的交替假单胞菌B3（菌种保藏号为：CGMCC NO.5353）。虽然，该试剂盒比较灵敏、稳定，被广泛使用，但是，其对设备要求高，操作复杂，价格极其昂贵（每个反应大约要几十元人民币）。