[发明专利]一种改造体抗菌肽及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明提供属于生物医学技术领域，具体的说是一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-1及其制备方法和应用。

背景技术

自由基指任何包含一个未成对电子的原子或原子团。生物体与外界接触和自身产生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、脂质过氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、单线态氧和臭氧。在较高浓度下，活性氧自由基对生物细胞的细胞结构、核酸、脂类和蛋白质造成损伤。造成DNA损伤，进一步引起复制错误、基因组不稳定、转录意外起始或终止，从而导致生物体变异或疾病发生；引起细胞膜流动性和通透性改变，导致细胞结构和功能改变；引起蛋白质氧化，导致蛋白质变性和失活。

目前发现，活性氧自由基与多种人类疾病有关，如癌症、心脑血管疾病、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病和衰老等。为了抵抗活性氧自由基对机体的损害，在漫长的进化过程中生物体形成多种不同的自由基清除系统，包括非基因编码的小分子物质，如尿酸、维生素C、维生素E、胡萝卜烯类、硫辛酸和辅酶Q等；基因编码的大分子抗氧化酶类，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、过氧化物酶、硫氧还蛋白酶系统和谷胱甘肽酶系统；基因编码的小分子抗氧化肽类，如从两栖类蛙科动物皮肤中发现的各种小分子抗氧化多肽。各种不同类型的自由基清除剂在医药和化妆品领域具有极大的应用潜力，如维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽。

昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)属于两栖纲无尾目蛙科蛙属，为中国特有种，仅分布于山东省烟台市昆嵛山。目前关于昆嵛林蛙形态、发育和分子进化已有报道，但是关于昆嵛林蛙来源抗氧化多肽的研究还没有报道。

发明内容

本发明的目的在于一种昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体抗菌肽Kunyuenin-1及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种改造体抗菌肽，改造体抗菌肽为昆嵛林蛙（Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin改造体Kunyuenin-1，其是直链多肽，含有14个氨基酸残基，分子量1586.98Da，等电点8.96。

所述改造体抗菌肽为：苯丙氨酸－亮氨酸－脯氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－丙氨酸－丙氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－精氨酸－赖氨酸－半胱氨酸。

改造体抗菌肽的应用，所述改造体抗菌肽用于制备抗氧化药物或化妆品添加剂的用途。

本发明的有益效果在于：本发明根据昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin的氨基酸序列，利用分子改造方法设计Kunyuenin的改造体Kunyuenin-1，该改造体具有极强的抗氧化活性和一定的抗菌活性，此外具有分子量小、结构简单、溶血活性低、制备方法简单等有益特点。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

昆嵛林蛙抗菌肽Kunyuenin基因克隆：

1）昆嵛林蛙皮肤总RNA提取：

①取300mg昆嵛林蛙皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1m1总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Invitrogen公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％（V/V）乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为昆嵛林蛙皮肤总RNA。

2）昆嵛林蛙皮肤cDNA文库构建：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer ^TM Directional cDNA Library Construction Kit。

（1）cDNA第一链合成(mRNA反转录)：