[发明专利]DNA甲基化的检测探针、检测方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种DNA甲基化的检测探针、检测方法及检测试剂盒。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，下一个重要任务之一就是解密遗传系统，即人体细胞在生长过程中是如何运用遗传物质来决定某一特定基因在何时何地得到表达。DNA甲基化因其能影响基因表达的遗传状态，已成为表观遗传系统中的一个重要部分。哺乳动物的DNA甲基化大多发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶上，即在胞嘧啶的嘧啶环上5号碳位置加入甲基。在正常细胞中，甲基化主要发生在重复的基因组区域，包括遗传元件和卫星脱氧核苷酸，然而与基因启动子和外显子相关的CpG岛屿通常是没有甲基化的。但是在这些区域上突变性的DNA甲基化能导致癌症抑制基因的转录沉默，这种突变性的DNA甲基化可以作为各种疾病包括癌症的标志。CpG岛屿上特定区域的甲基化可能与特定类型的癌症相关。因此，人类基因组中任一给定位置上DNA甲基化的准确定量对于人类癌症的早期治疗是非常重要的。

传统的已有多种用于分析单个CpG位置或短序列中DNA甲基化的检测方法。甲基化特异性的PCR（MSP）开启了将聚合酶链反应（PCR）用于甲基化分析的大门，但由于MSP的分析结果是通过观察凝胶电泳的现象，导致MSP仅能提供实验的定性分析而非定量分析。荧光标记实时监测PCR和甲基化特异性的量子点的荧光共振能量转移（MSq-FRET）等方法都需要精密控温的PCR仪，且一般需要使用荧光染料分子标记的探针，大大加重了实验成本。结合亚硫酸盐的限制性消化分析方法（COBRA）给定量且灵敏的DNA甲基化的检测提供了另一种选择，但是COBRA的前提条件是分析样品中要有甲基化敏感性的限制性消化酶的酶切位点。基于表面增强拉曼光谱法和单核苷酸扩增方法，由于较低的灵敏度导致应用受限。

发明内容

基于此，有必要提供一种灵敏度高、检测成本低的DNA甲基化检测探针及检测方法。

一种DNA甲基化检测探针，包括其5’端和3’端用于与甲基化DNA互补配对的序列以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增反应的特异性序列，其中，检测探针3’端的最后一个碱基为鸟嘌呤，所述鸟嘌呤与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至5’端的序列反向互补配对。

在其中一个实施例中，所述检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。

具有SEQ ID NO：1基因序列的检测探针可以应用在人类非小细胞肺癌细胞系基因组甲基化程度的检测领域。

该DNA甲基化检测探针，包括能与甲基化DNA互补的3’端和5’端以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增（HRCA）反应的特异性序列，且检测探针的3’端的最后一个碱基对应甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶，能特异性的与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对。若待测DNA为甲基化DNA，则其能与检测探针完全互补配对，且互补配对后导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA，从而不会被DNA外切酶III和I消化；而非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能与鸟嘌呤互补配对，非甲基化的DNA不能与检测探针完全互补配对，没有环状DNA的形成，从而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。环状DNA可以通过后续的HRCA反应及信号检测定量分析待测DNA的甲基化程度，由于HRCA具有超高扩增能力（10⁹倍信号放大），从而保证了检测的超高灵敏度要求。此外，使用该探针，检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记的探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。

一种DNA甲基化的检测方法，包括如下步骤：用亚硫酸氢盐处理待测DNA，使所述待测DNA中未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；向亚硫酸氢盐处理后的待测DNA中加入上述检测探针进行DNA融合反应；向融合反应得到的产物中加入DNA连接酶，进行连接反应；使用超分支滚环扩增方法扩增上步骤得到的产物并进行光谱信号检测。

在其中一个实施例中，所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾。

在其中一个实施例中，还包括在融合反应后向融合反应后得到的产物中加入DNA消化液，消化未完全互补配对的DNA序列的步骤。