[发明专利]用于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒及应用

说明书

技术领域

发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）在全世界范围内的感染患者超过3亿5千万，是诱发慢性乙肝和肝癌的主要原因。我国更是病毒性肝炎的高发区，HBV感染率高达57.63%，其中，大约80％肝癌由乙肝引起，严重威胁着我国公众的生命健康，所以对肝炎的诊断产品的研究具有重要的社会意义。

对人血清样本中HBV 总DNA的定量检测，可用于乙型肝炎的临床辅助诊断，确定是否有HBV感染以及病毒载量；并可通过监测患者血清HBV DNA水平的变化，对抗病毒药物的疗效进行辅助观察和判断。

HBV根据基因组序列可分为A-H共8种基因型，其中中国较常见的是B型和C型。 在长江以南地区，以基因型B型为主，占55%，长江以北C型为主，占81.6%。由于Orito等发现HBV 基本核心启动子（BCP）双突变在C型中明显比B型多见，也有研究认为C型HBV患者中DNA阳性率明显高于B型，且C型病毒感染者病毒低度也高于B型，B型感染者早与C型感染者10年发生HBeAg血清转阴，故C型感染者长期高水平的HBV DNA易导致病情加重。因此选取基因型C型为本试剂盒分型鉴定的指标，从而为治疗和预后提供帮助。

目前治疗乙型肝炎最常用的核苷类抗病毒药物包括拉米夫定、阿德福韦等，慢性乙肝患者长时间服用后容易发生病毒基因组特定位点变异，从而引发耐药。根据统计变异出现的概率大约为30%以上，大量样本的统计结果显示，常见的拉米夫定耐药突变位点如表1所示。最主要的耐药突变位点是M204，虽然也有173和180、181位点突变，但是这三个位点突变的拉米夫定耐药样本，基本上都同时联合有204位点的变异，因此，204位点是最主要的拉米夫定耐药突变监测位点。一旦检测到病毒变异，需要及时调整治疗策略。

表1

发明内容 

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能同时检测乙型肝炎病毒DNA总量、C型基因型和YMDD位点耐药突变（YVDD/YIDD）的四色荧光定量PCR检测试剂盒及其应用方法，在单管反应中同时对HBV DNA进行定量、鉴别HBV C型基因型、以及监测204位点YVDD和YIDD两种耐药突变发生情况。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测的试剂盒，该试剂盒含有两种引物及四种探针，各引物或探针的名称、DNA序列和荧光标记表2所示：

表2

所述各引物、探针与buffer、MgCl₂、含dUTP的 dNTPs装于一个容器内构成PCR检测混合液mix；该试剂盒还包括Taq酶、UDG酶，阴性对照样品和阳性对照样品(阴性对照为确认HBV DNA阴性血清；阳性对照为含1.0E+06 IU/ml HBV DNA目的基因片段的血清样本)；

在利用所述引物及探针建立的25μL PCR反应体系中，各组分的终浓度为：10倍反应缓冲液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U（U表示酶的活力单位）；UDG酶，0.1U；各条引物，各0.1μM；各条探针，各0.25μM；待测样品模板DNA（经核酸抽提方法处理过的待测血清或血浆样本，阳性样本中即含待测的HBV DNA）；5μL。

该试剂盒为32人份；试剂盒中的dNTPs中含有dUTP，和试剂盒中UDG酶共同构成防污染体系，防止PCR产物污染造成的假阳性结果。

应用上述试剂盒检测乙型肝炎病毒DNA总量、C型基因型和YMDD位点耐药突变（YVDD/YIDD）的方法，其过程包括利用所述引物、探针建立PCR反应体系，用煮沸法从待测标本中提取DNA，加入前述反应体系中，在荧光定量PCR仪上设定反应条件，进行PCR扩增和荧光型号检测；具体包括：

(1)利用所述引物、探针建立的25μL PCR反应体系如表3所示 

表3