[发明专利]一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA试剂盒及应用

权利要求书

1.一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成：

a）一种甲型H1亚型流感病毒 A-Influ/JML-F9;

b）一种特异性强的抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体；

c）抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；

d）盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品和阴性对照样品；

其中：

所述的试剂组分及其配比如下：

（1）样品稀释液的配制： PBS+TritonX-100+3%BSA；在121℃高压蒸汽下灭菌30分钟后分装，置4℃贮存；

（2）阳性血清的制备：选用4周龄健康仔猪，免疫前采血用血凝抑制试验方法检测阴性后，隔离观察7日,将甲型H1亚型流感病毒悬液甲醛灭活后，加入等量的佐剂乳化作为免疫原,通过颈部肌肉注射途径进行3次免疫，每次剂量分别为2mL、2mL、4mL，免疫间隔时间为21日,末次免疫后7～10日采血并分离血清，进行HI试验检测抗体效价,免疫猪抗体HI效价达到1:320时，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清备用,取备用血清经56℃灭活30分钟后用样品稀释液稀释，调整到ELISA方法检测OD_630nm值为0.8～1.6之间,按血清量的0.01％体积比加入硫柳汞，0.45μm滤膜过滤除菌,无菌分装，每管1mL；

（3）阴性血清的制备：选用4周龄健康仔猪，经血凝抑制试验检测为甲型H1亚型流感病毒抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用,取备用血清经56℃灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，调整到ELISA方法检测OD_630nm值低于0.2,按血清量的0.01％体积比加入硫柳汞，0.45μm滤膜过滤除菌,无菌分装，每管1mL；

（4）底物液A：0.006%H₂O₂缓冲液；

（5）底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.2 g，柠檬酸10.5g,用ddH₂O定容至500mL成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0；按终浓度为20mg/L添加联苯二胺；

（6）反应终止液：0.025% 体积比氢氟酸；HF 625μL，用ddH₂O定容至100mL；

（7）10倍洗涤液： NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 5mL，用ddH₂O定容至1000mL ，pH7.4。

2.权利要求1所述的一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型H1亚型流感病毒抗体检测中的应用，其检测步骤是：

（1）包被:以纯化抗原最佳包被浓度包被酶标板为100μl/孔，37℃孵育1h后置4℃过夜；

（2）洗板：弃包被液，PBST洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干酶标板，加入封闭液，200μl/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点；

（4）洗板：弃封闭液，同步骤（2）；

（5）加待检样品：拍干酶标板，加入待检样品，100μl/孔，设阴性对照，37℃孵育30min；

（6）洗板：弃待检样品液，同步骤（2）；

（7）加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体，体积比为1:800倍稀释，100μl/孔，37℃放置30min；

（8）洗板：弃酶标抗体，同步骤（2）；

（9）显色：每孔加入新配的底物液A、底物液B各50μl，室温避光显色10min；

（10）终止反应：每孔加入50μl反应终止液终止反应；

（11）测定OD₆₃₀值：酶标仪测定波长为630nm时OD值；

（12）根据PI计算公式算出每孔阻断率判断阴阳性，PI%=阴性对照OD值-样品OD值/阴性对照OD值-阳性对照OD值×100%。