[发明专利]用于检测人MTHFR基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于MTHFR基因c.665与c.1286两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，可以使5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，一方面可以作为甲基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面，在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中同型半胱氨酸再发生甲基化生产甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸可使血管内皮损伤及功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶系统，使机体处于血栓前状态，而慢性的细胞内同型半胱氨酸水平的升高可导致DNA低甲基化，染色体异常。近年来发现高同型半胱氨酸水平与包括心脑血管疾病、出生缺陷、妊娠相关疾病、糖尿病等多种疾病缺陷密切相关。

MTHFR基因常见的突变有两种：NCBI单核苷酸多态性数据库（db SNP）中的c.665位点C/T多态性（SNP ID:rs1801133）与c.1286位点A/C多态性（SNP ID:rs1801131）。其中，c.665位点C/T多态性是由Frosst等于1995年首次发现的，也是到目前为止发现的MTHFR最为常见的突变位点。研究表明，c.665位点C变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致MTHFR酶的热稳定性与酶活性降低，据文献报道，该位点在亚洲人群中突变的频率高达40%。另外，c.1286位点A变为C后，谷氨酸被丙氨酸取代，同样使MTHFR的酶活性下降，引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低，该位点在亚洲人群中突变的频率高达19%。

我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率；对于MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，叶酸代谢障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高，这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。

多年来，国内外对MTH FR多态性基因型进行分析，大多采用PCR-PFLP检测技术和DNA直接测序法。由于PCR-PFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。

发明内容

本发明针对现有技术检测MTHFR基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的MTHFR基因多态性检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性和/或c.1286位点（A/C）多态性，本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测人MTHFR基因多态性的检测引物及其相应探针，根据MTHFR基因c.665位点（C/T）多态性设计，序列如下所示：

反向引物：

MTHFR 665C: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGG-3’ （ SEQ ID No.1）；

MTHFR 665T: 5’-AGCTGCGTGATGATGAAATTGA-3’ （ SEQ ID No.2）；

正向引物：

MTHFR 665F: 5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’ （ SEQ ID No.3）；

荧光探针：

TM-MTHFR 665: 5’荧光基团-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’淬灭基团（ SEQ ID No.4）。

本发明还提供了一种用于检测MTHFR基因多态性的检测引物及其相应探针，根据MTHFR基因c.1286位点（A/C）多态性设计，序列如下所示：

正向引物：

MTHFR 1286A: 5’-GAGGAGCTGACCAGTGATGA-3’ （ SEQ ID No.5）；