[发明专利]耐辐射异常球菌R1 trkB基因培育耐盐植物的应用

说明书

技术领域

本发明涉及耐辐射异常球菌R1（Deinococcus radiodurans R1）trkB基因（DR1667，GeneID:1799538）的新功能，具体涉及该基因在增强植物对盐胁迫抗性方面的应用。 

背景技术

盐碱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位（Dracup et al.,1998）。耐辐射异常球菌R1（D.radiodurans R1）因对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。 

HKT(high-affinity K+transporter)基因家族转运蛋白具有可以调节植物体内K⁺/Na⁺平衡的能力，广泛存在于植物、真菌、真细菌和古细菌中。耐辐射异常球菌R1（D.radiodurans R1）含有2个HKT类蛋白，与植物Na+转运关系密切密切相关，对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性。 

钾是植物体必需的营养元素之一,钠是植物生长的功能元素,对于大多数植物而言,少量有益,过量则会产生毒害。植物对它们的吸收主要靠其体内的通道蛋白和转运载体。植物HKT转运蛋白与真菌Trk转运蛋白、原核生物的KtrB和TrkH的K转运蛋白的联系紧密,真菌中Trk转运蛋白是低K浓度下主要的K吸收系统。大多数植物中都可能存在HKT转运蛋白,这个基因家族并不是很大,在拟南芥中该家族只有一个成员。序列分析推测,这个家族的转运蛋白可能由细菌的2次跨膜结构的K通道进化而来,形成现在的8次跨膜和4个圈的一孔结构蛋白。HKT家族基因主要分为2个亚家族,亚家族1成员是特异性的Na低亲合转运蛋白,大部分分布于根系中柱的细胞质膜上,尤其是木质部薄壁细胞膜上,负责从木质部汁液中重新获取Na而阻止其向地上部的运输;而亚家族2成员是K/Na高亲合转运蛋白,尤其在K缺乏条件下负责对Na的吸收从而促进作物的生长,主要分布于根系的皮层和内皮层细胞膜上。 

Deinococcus radiodurans(D.radiodurans）是至今已知生物中最高的辐射抗性的生物之一。该菌具有对致死剂量的电离辐射、UV辐射以及DNA损伤试剂的极端抗性，能将电离辐射造成上百个DNA双链断裂的基因组完整恢复如初，且不发生突变的能力。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了D.radiodurans基因组全序列（White 1999）。尽管耐 辐射菌株与干旱胁迫抗性在进化上可能具有协同性，但目前未见耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的trkB基因（DR1667，GeneID:1799538）在增强植物耐盐性方面的功能的研究报道。 

发明内容

本发明的目的是从D.radiodurans R1基因组中发现能够增强植物对高盐的抗性基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。 

本发明通过如下研究发现，首次发现，SEQ ID NO:1所示序列的Deinococcus radiodurans R1的trkB基因（DR1667，GeneID:1799538）具有抗盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物： 

1、获得含有D.radiodurans R1 trkB基因（DR1667）的重组工程菌株 

1）通过PCR从D.radiodurans R1（DSM 20539）菌株基因组扩增出D.radiodurans R1trkB基因（DR1667），基因序列号为：GeneID：1799538。其大小为1377bp，该基因编码456个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整trkB基因的重组质粒pGEMT-trkB； 

2）将trkB基因（DR1667）连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整trkB基因（DR1667）重组质粒pRADZ3-trkB G； 

3）将导入trkB基因（DR1667）的重组质粒pRADZ3-trkB G转入受体大肠杆菌JM109中，获得工程菌株JM-trkB（详见实施例1）； 

2、含有D.radiodurans R1 trkB基因工程菌株的耐盐实验