[发明专利]基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法和试剂盒

权利要求书

1.基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）根据目的基因的突变位点设计ARMS引物，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；

（2）根据所述突变位点设计Taqman-MGB探针，所述Taqman-MGB探针特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子；

（3）提取模版DNA，利用步骤（1）所得引物对和步骤（2）所得探针对模板DNA进行荧光定量PCR检测。

2.根据权利要求1所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于：将所述突变位点上游第1位核苷酸中的错义突变。

3.根据权利要求2所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述突变位点为EGFR基因2573位错义突变，所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述基于Taqman-ARMS技术检测基因突变分型的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述Taqman-MGB探针为SEQ ID No：9所示的核苷酸序列。

5.权利要求1-4任一项所述方法使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测目的基因的突变位点的ARMS引物和Taqman-MGB探针，所述ARMS引物的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-3位核苷酸中的任一位错义突变；

所述Taqman-MGB探针为特异识别ARMS引物的扩增产物正义链突变位点的Taqman探针，所述探针的3’端结合有小沟结合分子。

6.根据权利权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述ARMS引物为SEQ ID No：3和SEQ ID No：5所示的核苷酸序列。

7.根据权利权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述Taqman-MGB探针的核苷酸序列如SEQ ID No：9所示。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA组成，各组分反应时终浓度为：

PCR缓冲液               终浓度0.5～2.5×；

dNTPs                      0. 1～0.75mM；

引物对                     上、下游引物终浓度分别为150～350nM；

模板DNA                 0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶         0.01～1.0U/μL；

MgCl₂                                 终浓度为1.5～3.5mM；

Taqman-MGB探针      终浓度为50～200nM。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR 缓冲液、dNTPs、引物对、Taqman-MGB探针、MgCl₂、TaqDNA聚合酶和模板DNA终浓度组成为： 

PCR缓冲液              终浓度1×；

dNTPs                      0.25mM；

引物对                     上、下游引物终浓度分别为250nM；

模板DNA                0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶         0.01～1.0U/μL；

MgCl₂                                 终浓度为2.0～2.5mM；

Taqman-MGB探针      终浓度为50nM。