[发明专利]一种麻疹病毒RT-tHDA检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种麻疹病毒RT-tHDA检测试剂盒及检测方法。

（二）背景技术

麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状与出疹为特征的急性传染病。自20世纪70年代全球实施扩大免疫规划（EPI）以来，全世界麻疹发病率、死亡率大幅度下降，但目前每年仍出现许多散发病例，并常常引起局部的流行。按照我国消除麻疹的工作要求，对出现的麻疹病例必须要进行实验室确认。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种依赖解旋酶恒温扩增技术快速检测麻疹病毒核酸的试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种麻疹病毒核酸的逆转录依赖耐热解旋酶恒温扩增（RT-Thermophilic Helicase-dependent Amplification，RT-tHDA）试剂盒，主要包括主要包括RT-tHDA反应试剂和特异性扩增引物，所述特异性扩增引物如下：

上游引物:5’-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’;

下游引物:5’-TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。

本发明试剂盒的关键在于引物的选择，RT-tHDA反应试剂为RT-tHDA反应中所用的常规试剂，如IsoAmp Enzyme Mix，MgCl2，hermoScript^TM Reverse Transcriptase等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要自行配制，或者直接购买时候HAD试剂盒，如Biohelix公司的HDA试剂盒等。

本发明还涉及利用所述试剂盒检测麻疹病毒的方法，所述方法包括：

（1）提取待测样品RNA；所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。

（2）以待测样品RNA为模板，加入特异性扩增引物和PCR反应试剂，配成RT-tHDA反应体系，进行扩增反应；

（3）对RT-tHDA反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现于110bp大小的电泳条带，则待测样品中含有麻疹病毒；反之则否。

本发明中，所述扩增反应条件为：65℃，120min。

所述RT-tHDA反应体系终浓度组成如下：

Invitrogen公司耐热逆转录酶ThermoScript^TM Reverse Transcriptase0.5μl

加水补齐至50μl。

目前，实验室确认麻疹的常用方法，包括血清学检测与病原学检测，前者用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测患者血清中的特异性麻疹免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M，后者则是以分离麻疹病毒和检测麻疹病毒核酸来进行确认。一般采用病毒分离、逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）或荧光定量RT-PCR方法进行核酸检测，但由于仪器成本较高，使其在基层推广时受到一定的限制。近年发展起来的依赖解旋酶的核酸等温扩增技术[Helicase-dependent Isothermal Deoxyribonucleic Acid(DNA)Amplification，HAD]，模拟体内DNA复制的自然过程，使其扩增反应的全过程均在单一温度下进行，无需专门的扩增仪器，克服了PCR反应需经历几十个温度变化的循环过程，特别适合在现场检测中应用。本发明自行设计特异性引物，建立了快速检测麻疹病毒核酸的逆转录依赖耐热解旋酶恒温扩增（RT-Thermophilic Helicase-dependent Amplification，RT-tHDA）方法，现将结果陈述如下。