[发明专利]一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。

背景技术

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种革兰氏阴性细菌，能感染包括虾类、贝类和鱼类等水产养殖动物，诱发危害严重的弧菌病。在鱼类中，已发现鳗弧菌可感染多种海水和淡水鱼，包括虹鳟、牙鲆、大菱鲆、鳗鲡、大黄鱼等。鳗弧菌是一种条件致病菌，其诱发的弧菌病容易发生在不良的养殖环境条件下，如高温、高养殖密度等。

在欧美，弧菌病防控多年来依靠灭活性多联疫苗。在我国，目前还没有商业化鳗弧菌疫苗。已报导的实验室鳗弧菌疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗，尚无减毒疫苗。减毒疫苗是通过对病原菌株人为突变，随后筛选毒力降低的突变株而获得。减毒疫苗的优点是能够通过细菌自身残留的毒力入侵宿主，从而模拟自然感染，诱发强大的宿主免疫反应。基于这一特点，许多减毒疫苗可通过浸泡和口服的方式传递，从而避免了昂贵的注射途径，因此在应用上有很好的市场价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种鳗弧菌减毒疫苗及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种鳗弧菌减毒疫苗,减毒疫苗菌株为鳗弧菌C312在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为100ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株C312RM。

将鳗弧菌C312在含有1.5ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天，挑取转化子，将转化子在含有3ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天选取转化子，将转化子在含有6ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天选取转化子；如此重复，直至LB培养基中利福平浓度达100ug/ml，由此获得的转化子即为减毒疫苗菌株C312RM。

所述减毒疫苗菌株C312RM与海藻酸钠微球按体积比1：1.67混合，作为海豚链球菌免疫口服药物；或将减毒疫苗菌株C312RM于LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.8-1离心沉淀于海水中重悬作为海豚链球菌免疫浸泡药物。

本发明具有如下优点：本发明的疫苗可经由口服或浸泡方式传递，因此避免了常规的注射传递模式，操作简单，成本低廉，可以广泛用于各种养殖条件，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

实施例1

鳗弧菌减毒疫苗的构建方法：

将鳗弧菌C312在含有1.5ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天，挑取一个转化子，将转化子在含有3ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天，挑取一个转化子，再将转化子在含有6ug/ml利福平的LB培养基中培养4－5天，挑取一个转化子。如此逐渐升高利福平浓度，直至利福平浓度达100ug/ml，（在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养梯度为，1.5ug/ml、3ug/ml、6ug/ml、12ug/ml、24ug/ml、48ug/ml和100ug/ml），在此培养基中挑取一个转化子，命名为C312RM。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。

所述鳗弧菌C312保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.6250，保藏日期2012.6.21，分类命名为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。

实施例2

C312RM毒力检测：用半致死量（LD₅₀）测定方法（具体方法参见文献Wang H,Hu Y,Zhang W,Sun L.Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescens strain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine.Vaccine2009;27:4047－55）检测C312RM与野生株C312的毒力，发现野生株C312的LD₅₀为10⁶CFU，而减毒转化子C312RM的LD₅₀为1.5x10⁸CFU。因此，较之于野生株C312,减毒转化子C312RM的毒力大幅下降，是一株减毒株。

实施例3