[发明专利]非限制性构建无缝质粒表达载体的方法

说明书

技术领域：

本发明专利涉及一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，重组质粒构建的方法，属于基因工程或分子生物学技术领域。 

技术背景：

在构建重组质粒实验过程中，经常需要两个基因片段融合并确保得到的质粒能正确表达所需要的氨基酸序列。对于此类的质粒构建，经常遇到所使用的质粒载体中无合适的酶切位点，导致常规的内切酶处理-连接酶连接的方法不适用。目前构建这一类重组质粒的主要方法有PCR定点突变产生酶切位点法，细菌体内同源重组法，平齐末端连接法，PCR与T4DNA聚合酶结合产生粘性末端连接法，In-Fusion法等。通过DNA突变产生酶切位点的方法是利用氨基酸编码序列的简并性产生酶切位点同时又保证氨基酸序列正确，该方法非常繁琐从而限制了其广泛使用。体内同源重组法是利用位于目的片段两端与受体质粒同源的序列在细菌细胞内与受体质粒发生同源重组而得到所需的质粒；这一方法虽然简单，但效率低，不能确保成功。平齐末端连接法的缺点为连接效率低，且重组质粒有50％的几率含有反向连接的目的片段。PCR与T4DNA聚合酶结合产生粘性末端连接法简单易行，但要求在目的片段末端12个碱基中不含四种碱基中的其中一种。In-Fusion法的缺点为构建重组质粒成功率与序列有关。近年来，Bitinaite等人发现了一种新的构建重组质粒的方法，即利用USER(Uracil-Specific Excision Reagent)酶产生粘性末端，将多个DNA片段“无缝”连接，然后插入载体中。这一方法的缺点是需要特定的载体pNEB206A。 

发明内容：

本发明的目的在于提供了一种非限制性构建无缝质粒表达载体的方法，该方法实现了将目的DNA片段插入任何质粒载体或置换质粒载体的任何部位，在构建融合基因后确保融合基因开放阅读框的正确性；构建过程操作简单，构建重组质粒的效率高 

技术解决方案： 

本发明是利用化学合成两对含有dU的PCR引物，用于分别放大目的DNA片段和质粒载体，然后使用USER酶酶切放大的目的DNA片段和质粒载体PCR产物使其末端产生互补的粘性末端，再将其产物的混合物转入感受态E.coli细胞，利用细胞内的重组机制产生所要的质粒。 

方法步骤如下： 

(1)依据目的片段的DNA序列和载体质粒的DNA序列，写出重组质粒的DNA序列； 

(2)PCR引物设计：设计两对含有dU的PCR引物； 

a.第一对引物用于扩增目的DNA片段： 

设计方法是根据重组质粒DNA序列在插入目的DNA片段与质粒载体之间5′端和3′端靠近接缝处各找一长度为6-11个碱基序列作为5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区；5′粘性末端搭接区和3′粘性末端搭接区是第一个碱基为A，最后一个碱基为T的DNA序列；设计正向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入目的片段部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补； 

b.第二对引物是用来扩增质粒载体： 

正向引物设计方法是使其5′端的DNA序列与3′粘性末端搭接区一致，正向引物对应粘性末端搭接区3′T的位置用dU替换，正向引物其它部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其一致；设计反向引物使其5′端的DNA序列与5′粘性末端搭接区反向互补，反向引物对应粘性末端搭接区5′A互补的位置的T用dU替换，反向引物其余部分的DNA序列需跨入质粒载体部位DNA序列至少10个碱基，与其反向互补； 

(3)PCR扩增：使用上述设计的两对引物，分别以含有目的DNA片段的质粒和载体质粒作为模板，采用高保真度DNA聚合酶进行PCR扩增分别得到目的片段DNA和质粒载体DNA；PCR产物用1μl(20个酶活单位)Dpn I酶37℃水浴1-2h以去除模板DNA； 

(4)用USER酶处理PCR产物：取1μl(10个酶活单位)USER酶加入步骤(3)Dpn I酶处理后的产物(无需纯化)中，37℃水浴1-2h后6-11个碱基的DNA片段会自动脱落，产生目的DNA片段和质粒载体相匹配的粘性末端；