[发明专利]一种甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗的方法，属于甘蔗遗传育种研究领域。

背景技术

远缘杂交是进行植物遗传学、育种学和进化研究的重要途径，现已成为植物育种取得突破性进展的关键环节之一。离体培养技术是一项简单实用的生物技术，要求的器材简单，在普通的植物组织培养实验室中就可以进行。这一技术应用于拯救败育或发育不良的远缘杂种胚，将杂交种子进行体外培养，从而可以提高种子成苗率，获得可育的实生苗后代。目前，胚离体培养技术已广泛应用于水稻、小麦等粮食作物，在甘蔗等经济作物中的应用前景也非常值得期待。但是，由于影响杂种胚生长的因素十分复杂，而不同物种不同杂交组合杂种胚生长的条件各不相同，致使杂种胚的离体培养拯救难于程序化，必需针对不同的杂种胚进行各种影响因素的优化，建立起适用于不同物种和组合的杂种胚离体培养育苗体系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗的方法，是一种能简便高效地通过甘蔗杂交种子离体培养获得实生苗后代的有效方法，该方法有利于提高甘蔗杂交种子的萌发率和成苗率。

本发明通过以下技术方案实现：一种甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗的方法，其特征在于以甘蔗杂种胚作为外植体，先接种到改良的KC萌发培养基上进行萌发培养，出苗后转移到改良的N6生根培养基上诱导生根；

所述的甘蔗杂种胚外植体为人工剥离后的甘蔗杂交花穗种子；

所述改良的KC萌发培养基配方为：KC + 1 mg/L IBA + 30g/L蔗糖 + 4g/L琼脂，pH5.8；

所述改良的N6生根培养基配方为：?N6（?大量元素，其它成分不变）+ 2 mg/L NAA+30g/L蔗糖 + 4g/L琼脂 + 0.2g/L活性炭，pH5.8。

本发明以不同组合的甘蔗远缘杂交花穗种子作为培养材料，试验了MS、Knudson C（KC）、N6等多种改良培养基，并对添加不同2.4-D和IBA浓度的培养基进行了比较研究，最终获得了适合甘蔗远缘杂种胚离体培养使用的萌发培养基和生根培养基，建立起一套便捷的甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗的方法。

本发明以不同杂交组合的甘蔗杂种胚作为外植体，先接种到改良的KC萌发培养基上进行萌发培养，出苗后转移到改良的N6生根培养基上诱导生根，注意种子萌发后周围的稠状体应切去，在幼苗生根培养中有利于小苗的成活，该方法能使得甘蔗杂种胚萌发率和生根成苗率得到显著提高。

所述的甘蔗杂种胚外植体为人工剥离后的甘蔗杂交花穗种子，依次经70％酒精消毒60s和1‰升汞溶液消毒6min处理。

所述改良的KC萌发培养基配方为：KC + 1 mg/L IBA + 30g/L蔗糖 + 4g/L琼脂，pH 5.8；改良的N6生根培养基配方为：?N6（?大量元素，其它成分不变）+ 2 mg/L NAA+30g/L蔗糖 + 4g/L琼脂 + 0.2g/L活性炭，pH5.8。

本发明提出的甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗方法与常规甘蔗实生苗育苗技术相比具有显著优点，由于采用了经试验改良的萌发培养基和生根培养基进行阶段性培养，使得甘蔗杂种胚细胞在出苗和生根不同阶段的细胞分化得到了充分增殖，仅用了一个10天左右的出苗培养和一个2周的生根培养周期，即可得到生根的幼苗。本发明简化了育苗程序，缩短了育苗周期，降低了劳动力成本，提高了甘蔗远缘杂种胚的萌发率和生根成苗率，可为相关甘蔗科研单位和育种机构在进行实生苗育苗时提供参考借鉴。

具体实施方式：

甘蔗远缘杂种胚离体培养育苗方法，具体实施中用到的仪器设备有：超净工作台、灭菌锅、低温冰箱和光照培养箱等，其详细实施步骤如下：

1．杂交花穗种子剥离

采集甘蔗杂交花穗，人工剥离留取杂交种子，保存至-20℃低温冰箱备用。

2．培养基配制

按照下列培养基配方，依次配制KC/N6培养基母液于﹣4℃冰箱保存备用。

诱导种子萌发KC改良培养基：KC + 1 mg/L IBA + 30g/L蔗糖 + 4g/L琼脂；

诱导幼苗生根N6改良培养基：?N6（?大量元素，其它成分不变）+ 2 mg/L NAA+30g/L蔗糖+4g/L琼脂 + 0.2g/L活性炭； 

以上培养基均为固体培养基，pH5.8。

3．种子消毒接种及离体培养

剥取的甘蔗种子用灭菌纱布包好放在无菌水中泡洗3次，70％含水量的酒精消毒60s，1‰升汞溶液消毒6min，无菌水泡洗5次；接种时用灭过菌的勺把种子取到滤纸上吸去表面水分，在酒精灯旁干燥后用镊子将种子接种到KC萌发培养基上，封口置于光照培养箱中培养观察；待种子出苗长到4-5cm时(10天左右)，切去幼苗根部稠状体，转接到N6生根培养基上光照培养箱继续培养，1周后幼苗开始生根，2周后可获得根系生长情况良好的组培实生苗。