[发明专利]一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，属于高分子化合物的多糖领域以及医药技术领域。 

背景技术：

随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。目前全球糖尿病患者已超过1.2亿人，我国患者人群居世界第二位。根据发病机制不同，糖尿病分为Ⅰ型糖尿病（胰岛素依赖型）和Ⅱ型糖尿病（非胰岛素依赖型），其中Ⅱ型糖尿病约占总数的85%以上。根据治疗机理不同，治疗Ⅱ型糖尿病的药物可以分为：1）促胰岛素分泌剂，如磺酰脲类；2）胰岛素增敏剂，如屈吉他宗等噻唑烷衍生物；3）α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖（Acarbose）等。目前α-葡萄糖苷酶抑制剂药物被认为是Ⅱ型糖尿病的首选药和I型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物。 

现代药理学研究表明，天然产物中得到的多糖具有抗肿瘤、抗凝血、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂和促进机体免疫力的生物活性。缘管浒苔(Enteromorpha linza)是我国东南沿海生长十分丰富的大型绿藻，东南亚国家重要的食物资源，作为药用历史也已有二百多年，《本草纲目》中即有记载。其中的多糖成分是它们多种生物活性的物质基础，而且，从天然产物中得到的多糖没有细胞毒性，这为其应用于药物和食品领域奠定了安全的基础。国内外关于其中多糖生物活性的报道主要集中在增强免疫活性方面，目前尚未见对缘管浒苔多糖降血糖活性的研究，本发明方法将为缘管浒苔这一丰富的可再生资源的深入开发和利用提供科学依据。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的制备方法，并明确其单糖组成，为其应用于食品和药物中提供科学依据。 

为了实现上述发明目的，本发明方法通过以下技术方案实现： 

第一步，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的提取，按照如下步骤操作： 

1）将缘管浒苔粉碎后过80目筛,加入8倍体积水，于100℃下加热回流3h，重复回流三次，用4层纱布过滤，合并滤液，滤液于3000×g离心20min，除去细微不溶物； 

2）将滤液用sevag法脱蛋白，收集上清液，减压蒸馏浓缩至原体积1/4，加入3倍体积的乙醇在4℃下放置过夜，抽滤，透析，冷冻干燥，得到固体缘管浒苔粗多糖； 

第二步，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖的分离纯化，按照如下步骤操作： 

1）将固体缘管浒苔粗多糖配成10mg/mL的溶液，离心，取上清液上Q-Sepharose Fast Flow 凝胶柱； 

2）分别用H₂O、0.2M、0.5M、0.8M和1.0M的NaCl溶液洗脱；其中，0.5M的NaCl洗脱得到的组分为具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的缘管浒苔多糖； 

3）用苯酚-硫酸法检测并合并组分，透析，冷冻干燥制得分离纯化后的缘管浒苔多糖。 

本发明所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖为酸性多糖，含有SO₄²-基团。 

本发明所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多糖，其单糖组成为：甘露糖、L(-)-岩藻糖、D-葡糖糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖和D-木糖，它们的摩尔比是：1.00:0.66:0.46:0.41:0.27:0.19。 

本发明测定了分离纯化后缘管浒苔多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性，方法如下：混合102μL磷酸盐缓冲液(PBS 0.5M,pH 6.8)、102μL不同浓度的缘管浒苔多糖样品、282μLH₂O和200μL对硝基苯-α-D-半乳糖苷(pNPG，6mmol/L)；混合液于37℃水浴中保持5min，再加入200μLα-葡萄糖苷酶(0.1U/mL)，37℃保持30min；最后加入0.4M(pH=10.4)甘氨酸缓冲液1.2mL终止反应。以阿卡波糖为阳性对照，紫外分光光度计测定410nm处的吸光度值A。空白、背景和样品的测定条件相同。 

抑制率(%)=[Ac-(Ai-Ab)]/Ac×100%，其中，Ac：空白对照；Ab：背景吸收；Ai：样品吸收；样品的降血糖活性用IC₅₀表示，IC₅₀通过GraphPad软件计算得到。 

经体外α-葡萄糖苷酶抑制试验表明，提纯后的缘管浒苔多糖具有非常强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，具有明显的降血糖活性，可用于治疗II型糖尿病，对于海藻和海洋资源的开发具有重要意义。