[发明专利]一种多孔单细胞观测板及其应用

说明书

技术领域

微流控芯片（Microfluidic chip）技术是近几年飞速发展的领域,其特征主要是其容纳流体的有效结构（通道、反应室和其它某些功能部件）至少在一个纬度上为微米级尺度。微流控芯片把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块厘米尺度的芯片上，由于它可实现高通量的细胞阵列，精确的控制细胞培养环境，快速的进行分析，大量的减少试剂的消耗，而成为现在做细胞分析的最有力的工具。但之前的大多数研究工作都需要借助自动注射泵系统，例如Luo等人（C.Luo,X.Zhu,T.Yu,et al.，A fast cell loading and high-throughput microfluidic system for long-term cell culture in zero-flow environments，Biotechnology and Bioengineering,2008，101,190-195.）和Wang等人（L.Wang,X.Ni,C.Luo,et al.，Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices,Biomedical Microdevices,2009，11,679-684.）的研究，其与现行的排枪或者自动点液系统不能兼容，难以做到真正意义上的高通量（48个不同样品及以上），而现有的商用多孔板并不适合做实时的酵母单细胞跟踪。

最近，有报道（G.Yang,Quan,Y.,Wang,W.,et al.,Dynamic equilibrium between cancer stem cells and non-stem cancer cells in human SW620 and MCF-7 cancer cell populations，BRITISH JOURNAL OF CANCER,2012,106,1512-1519.）利用小孔和微流道结合的方式，利用聚合物PDMS材料的特殊吸气性质，在去气后导入癌细胞，而后更替小孔中的癌细胞溶液为培养液，此操作杜绝了传统多孔板换液操作对细胞的影响，适合用以作癌细胞的染色和实时观测。该技术对于高通量的酵母细胞研究仍不适用。

发明内容

针对研究细胞领域的不足之处，本发明提出一种多孔单细胞观测板。

本发明另一目的是提出应用所述多孔单细胞观测板的方法。

实现本发明上述目的的具体技术方案为：

一种多孔单细胞观测板，包括多个小孔单元，每个小孔单元包括一个小孔、多个重复的细胞培养室和扩散通道，每个细胞培养室通过扩散通道与小孔连接。

其中，小孔单元的数目为1-1000个，小孔的直径为2-4mm，小孔的孔间距为4-10mm且孔间距均相等。孔间距均等，使得该多孔单细胞观测板可以与本领域常用的排枪和自动点样仪所适配。

所述扩散通道的高度、宽度或直径均大于细胞的特征尺寸。通道的尺寸大于细胞的直径，可以让细胞或细菌通过。例如，芽殖酵母细胞对于不同的突变株一般大小范围为3-7μm，裂殖酵母直径为3.5μm，杆菌尺度1-3μm。

其中，细胞培养室的高度为细胞最小特征尺寸的1-2倍。细胞培养室的高度不超过所研究的细胞最小特征尺寸的两倍，细胞在培养室为单层生长。

所述的多孔单细胞观测板是用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成。

一种制备本发明提出的多孔单细胞观测板的方法，是使用软光刻和打孔的方法制备所述多孔单细胞观测板。

应用本发明提出的多孔单细胞观测板观测细胞的方法，包括步骤：

1）等离子处理所述多孔单细胞观测板，然后把所述多孔单细胞观测板置于一平面上；

2）将含有细胞的溶液均匀加入所述多个小孔中；

3）当所述小孔、细胞培养室、扩散通道均被含有细胞的溶液充满后，去除小孔内的残留的含有细胞的溶液。

由于PDMS在等离子体处理后对液体的浸润性和对气体吸收的特性，细胞溶液自动被吸收入细胞（微生物）培养室，当细胞培养室被液体填充完成，细胞培养室内液体流速降为零。由于细胞培养腔室吸满后为死区，更替小孔内溶液时，细胞培养室液体不会流动，只通过扩散交换营养。

其中，所述步骤3）中，去除小孔内的残留的含有细胞的溶液后，还包括用不含细胞的溶液充满小孔的步骤。通过排枪或者液体点样机更替小孔内的液体实现去除小孔内的细胞溶液并实现对细胞培养室内细胞（微生物）的环境更替。所述不含细胞的溶液优选使用细胞培养液。