[发明专利]小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

说明书

技术领域

本发明涉及以原核表达的β-Tubulin蛋白免疫小鼠获得的分泌β-Tubulin单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G7，属于生物工程技术领域。

背景技术

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种微管蛋白，其中α微管蛋白(α-Tubulin)和β微管蛋白(β-Tubulin)可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种微管蛋白。β-Tubulin是由455个氨基酸组成，分子量为55kDa。α-Tubulin和β-Tubulin这两种微管蛋白具有相似的三维结构,能够紧密地结合成二聚体,作为微管组装的亚基。

微管壁由13个原纤维排列组成，微管可装配成单管，二联管（纤毛和鞭毛中），三联管（中心粒和基体中）。细胞内微管以胞质微管和纺锤体微管两种形式存在，主要参与细胞运动、细胞器的定位、胞内物质的运输及真核细胞的有丝分裂过程。细胞进入分裂期，其胞质微管解聚成微管蛋白后再组装成纺锤体微管。在分裂后期，纺锤体微管牵引着姐妹染色单体从赤道面移向纺锤体的两极。在有丝分裂结束后，纺锤体微管解聚再组装成胞质微管。因此，这种微管蛋白／微管之间的动态循环(聚合和解聚)，为细胞正常有丝分裂所必需。若破坏此循环将致使进入有丝分裂期的细胞停止分裂，进而延长细胞周期或诱导细胞凋亡。

肿瘤细胞具有快速增殖能力，若抑制其纺锤体的形成，必将导致有丝分裂过程的阻断，使得肿瘤细胞生长停滞于G2／M期。β-微管蛋白可专一性地与某些抗有丝分裂药物，如秋水仙碱(colchicine)、长春花碱和鬼臼素等相结合。一旦与药物相结合后就阻止其他蛋白单体的继续添加而抑制微管的聚合，同时还通过诱导微管的解聚抑制纺锤体的形成，使细胞的有丝分裂停止于M期，从而阻止细胞分裂繁殖；紫杉醇类等药物在β-微管蛋白上的结合腔靠近异二聚体和原丝间的重要作用区域，因而在药物与微管蛋白结合的同时也加强了异二聚体和原丝间的结合，结果促进了微管蛋白的聚合又能稳定已形成的微管(抗低温及抗Ca²⁺的解聚)，使细胞分裂停止于G2／M期。

与正常细胞相比较，肿瘤细胞对细胞凋亡的诱导更加敏感，作用于微管的抗癌药物更容易杀死肿瘤细胞，与其他类型药物相比具有更好的疗效。另外，β-微管蛋白表达异常与肿瘤的恶性生物学行为密切相关，大量的研究表明，α、β-微管蛋白异常表达也出现在直肠癌、乳腺癌、胶质瘤等肿瘤细胞中。故监测β-微管蛋白在癌变过程中表达水平的变化对肿瘤治疗研究以及提高肿瘤细胞对药物的敏感性，改善预后都具有重要意义。

其次，由于β-Tubulin的蛋白在大部分细胞中的表达比较恒定，因此也被广泛用于Western Bloting实验时的内参，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

抗β-Tubulin小鼠单克隆抗体可以通过与β-Tubulin的特异性结合再加上相应荧光标记或酶标二抗共同作用对β-Tubulin进行染色来观察细胞结构，或者检测实验样品中β-Tubulin的表达量进而调整上样量，确定上样量相等，进而比较不同条件下或者不同组织中目的蛋白表达量变化。

目前，国内外已经获得了多种β-Tubulin的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的β-Tubulin的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、用于科研或临床、可用于科研或临床免疫组化检测β-Tubulin表达、Western Bloting实验时的内参、以及免疫染色观察细胞的微管结构的小鼠抗人β-Tubulin单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）根据β-Tubulin的基因序列（NM_006086.3）的编码框，设计1对特异引物，Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增β-Tubulin基因，构建重组表达载体PET28a-β-Tubulin，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。

（2）采用经典的细胞融合技术制备β-Tubulin单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。