[发明专利]一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)为百合科葱属植物，起源于中亚地区，4000多年前就已经开始种植，具有药食两用的功效，长期以来在我国广泛栽培种植。但近年来，随着大蒜种植面积和产业化发展迅速，病虫害也日益严重，成为限制其进一步发展的主要因素，其中大蒜叶枯病对大蒜蒜薹、蒜头产量为害严重。

大蒜叶枯病（Garlic leaf blight）属于真菌病害，其病原菌的无性阶段为半知菌类的匍柄霉，有性阶段为子囊菌门的格孢腔菌。两个阶段的病菌均可侵染大蒜，但以无性阶段的病菌侵染为主。该病主要危害大蒜的叶和花梗，严重时造成蒜叶枯死、大蒜不抽薹等症状，此病的发生造成严重损失，影响大蒜的稳产高产；目前，虽然有一些化学药物可用来防治叶枯病，但效果不明显，而且大量用药还会引起产品农药残留增加，降低食用安全性，因此，要从根本上解决叶枯病，必须选育抗病品种，然而到目前为止，国内外对大蒜抗病突变体筛选方法的报道很少，仅张林青（2008）报道了大蒜抗白腐病细胞无性系变异，但是仅获得少于的抗性鳞茎，且未利用分子手段进行鉴定。因此目前急需开发出能成功地筛选大蒜抗病突变体的方法。

发明内容

本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，本发明提供一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，本方法操作简便，易于掌握。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为 ：一种筛选大蒜抗叶枯病体细胞突变体的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）以大蒜茎盘为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为0％、10％、20％、30％、40％的筛选培养基上，确定筛选压；(2)以大蒜茎盘为外植体，在 MS+B₅有机+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +5％毒素的培养基上培养30天，诱导出抗性胚性愈伤组织；(3)将诱导出的抗性胚性愈伤组织逐次接种到粗毒素体积分数分别为5％，10%，15%，20%，25%的愈伤组织增殖培养基MS+B₅有机+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L上，以利用多步法筛选抗性胚性愈伤；（4）将步骤3中所得到的抗性胚性愈伤接种至不含毒素的增殖培养基中，使筛选到的抗性胚性愈伤恢复生长；（5）将步骤4中抗性胚性愈伤组织接种到含25％粗毒素的芽分化培养基MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L上，促使芽分化，获得抗性芽；（6）将得到的抗性芽接种至无毒素的芽分化培养基上，使抗性芽恢复生长；（7）将得到的抗性芽接种至无激素的MS基本培养基上诱导生根，使其继续长成具有根、茎、叶的完整再生植株；（8）用SSR和SRAP标记对抗性植株进行分子标记鉴定。

所述步骤（1）中的大蒜选择健康饱满的蒜瓣，去皮，在自来水下冲洗1h，后在无菌条件下用75％酒精浸1min，再用0.5％次氯酸钠消毒20～25min，无菌水冲洗4～5次待用，在超净工作台上切去蒜瓣上部的贮藏叶，剩下约5mm厚带发芽叶基的茎盘，十字切成4块为外植体，分别接种在粗毒素体积分数分别为0％、10％、20％、30％、40％的筛选培养基上，接种时使外植体伤口与培养基表面充分接触，培养条件为：温度20～25℃，光照2000Lx，14h光照/10h黑暗条件下培养30天后，根据各处理愈伤组织诱导率及发育状况，确定适宜的抗性筛选压为25％。

所述步骤（2）的具体方法为：以大蒜带发芽叶基的茎盘为外植体，接种在含粗毒素为5％的MS+B₅有机+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L的培养基上，培养30天，得到抗性胚性愈伤组织。

所述步骤（3）的具体方法为：配置附加不同体积分数的粗毒素增殖培养基MS+B₅有机+2,4-D 0.5 mg/L+KT1.0 mg/L，粗毒素按每5％为一个梯度，直至粗度素体积分数为25％，分别将抗性愈伤组织接种到上述粗毒素的增殖培养基上，使胚性愈伤组织增殖，每30天为一个培养周期。

所述步骤(5)的具体方法为：将所得到的抗性愈伤组织接种至粗毒素分数为25％的MS+KT 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L的芽分化培养上，培养30天，获得抗性芽。

所述步骤(8)的具体方法为：对所得到部分再生植株利用SSR 和SRAP标记手段进行分子鉴定。