[发明专利]一种AraC突变体蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。

背景技术

四氢嘧啶，中文全称为1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，英文全称为1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarbo xylic acid;ectoine。结构式见式（Ⅰ）。

四氢嘧啶是微生物应答环境渗透压胁迫合成的一种渗透压补偿性溶质，可以平衡细胞的渗透压，在高温、冷冻和干燥等逆境下，对酶、DNA、细胞膜和整个细胞提供保护作用，可作为化妆品保湿剂和酶蛋白稳定剂等，在化妆品、生物制剂、酶制剂和制药等领域具有广泛的应用前景和开发价值。

目前四氢嘧啶的研究主要集中在提高四氢嘧啶产量，但是由于缺乏高通量筛选手段，限制了四氢嘧啶生物合成途径的改造研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种AraC突变体蛋白及其应用，具体涉及AraC突变体蛋白在高通量筛选合成四氢嘧啶的菌株中的应用。

本发明提供的AraC突变体蛋白，命名为AraCm蛋白，属于人工序列，为序列表的序列3所示的蛋白质。

编码所述蛋白质的基因（araCm基因）也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1）至3）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列4所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有araCm基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为将araCm基因插入pMAL-p2x载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为在pMAL-p2x载体的NdeI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种试剂盒，包括质粒甲和质粒乙；所述质粒甲为在表达载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒；所述质粒乙为在表达载体的多克隆位点插入特异DNA片段得到的重组质粒；所述特异DNA片段包括序列表的序列5中自5’末端第329至402位核苷酸所示的PBAD启动子和荧光蛋白的编码基因。所述质粒甲具体为在pMAL-p2x载体的多克隆位点插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒；所述质粒乙具体为在pDHC29载体的多克隆位点插入所述特异DNA片段得到的重组质粒。

所述荧光蛋白具体可为GFPuv蛋白。所述GFPuv蛋白为序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸编码的蛋白质。所述荧光蛋白的编码基因（gfpuv基因）具体可如序列表的序列5自5’末端第445至1164位核苷酸所示。所述特异DNA片段具体可如序列表的序列5所示。

所述质粒乙更具体可为在pDHC29载体的KpnI酶切位点插入序列表的序列5所示双链DNA分子得到的重组质粒。

所述质粒甲更具体可为在pMAL-p2x载体的NdeI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4自5’末端第4至879位核苷酸所示DNA分子得到的重组质粒。

所述试剂盒还可包括宿主菌；所示宿主菌为敲除大肠杆菌基因组中的araC基因得到的工程菌。所述宿主菌具体可为JW0063-1菌株。所述araC基因如序列表的序列2所示。

所述蛋白质、所述基因、所述重组表达载体或所述试剂盒的应用，为如下（a）或（b）或（c）：（a）鉴定四氢嘧啶；（b）检测四氢嘧啶的含量；（c）筛选生产四氢嘧啶的菌株（特别是高产菌株）。

本发明还保护一种筛选受四氢嘧啶特异诱导的AraC突变体蛋白的方法，包括如下步骤：

（1）将AraC突变体文库和辅助质粒共转化宿主菌，得到重组菌；

（2）阴性筛选

将步骤（1）得到的重组菌进行IPTG诱导，分选荧光最低的细胞；

（3）阳性筛选

将步骤（2）得到的细胞进行四氢嘧啶诱导，用分选荧光最强的细胞；