[发明专利]罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，包括病毒DNA提取试剂和LAMP反应试剂，其特征在于所述的LAMP反应试剂中含有用于检测罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增用核酸引物组，该引物组包含引物MRNuV-FIP、引物MRNuV-BIP、引物MRNuV-F3、引物MRNuV-B3、引物MRNuV-LF和引物MRNuV-LB；

所述的引物MRNuV-FIP序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物MRNuV-BIP序列如SEQ ID NO：2所示；

所述的引物MRNuV-F3序列如SEQ ID NO：3所示；

所述的引物MRNuV-B3序列如SEQ ID NO：4所示；

所述的引物MRNuV-LF序列如SEQ ID NO：5所示；

所述的引物MRNuV-LB序列如SEQ ID NO：6所示。

2.如权利要求1所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的病毒DNA提取试剂包含以下组分：含有5～15 mM Tris、0.5～1.5 mM EDTA ，pH 8. 0的TE缓冲液；RNase A，浓度10 mg/mL；蛋白酶K溶液，浓度20 mg/mL， pH8.0； Tris饱和酚，pH8.0；乙酸钠水溶液，浓度3 mol/L；乙醇，浓度95%。

3.如权利要求1所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的LAMP反应试剂包括以下组分：

1）LAMP预反应液：20～25mM pH为8.2～9.0的Tris-HC1、5～10mM硫酸镁、10～12mM氯化钾、6～12mM硫酸按、0.l～0.2% Triton X-100、1～1.6 mM dNTP、0.5～1.0 M甜菜碱、1.5～2.2μM引物MRNuV-FIP、1.5～2.2μM引物MRNuV-BIP、0.15～0.3μM引物MRNuV-F3、0.15～0.3μM引物MRNuV-B3、0.6～1.2μM引物MRNuV-LF和0.6～1.2μM引物MRNuV-LB； 

2）聚合酶：每微升含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

3）LAMP反应稳定液：由矿物油或液体石蜡油组成；

4）LAMP反应显色液：含有10 % SYBR Green I的荧光染料。

4.利用权利要求3所述的罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP检测试剂盒进行LAMP检测的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）DNA抽提：取罗氏沼虾幼体去眼后的头胸部或是成虾鳃组织抽提出待检测DNA的数目；

2）罗氏沼虾诺蒂病毒的LAMP扩增：

①根据待检测DNA的数目，设置所需LAMP反应管数N，N=样品数+2，其中l管为阳性对照，l管为阴性对照；

②吸取所述的LAMP预反应液的体积为N×23 μL，加入一洁净的1.5mL离心管中，然后加入NμL Bst DNA聚合酶，混合均匀，1500～2000转/分钟离心10秒，取上清之混合液；

③向设定的N个LAMP反应管数中分别加入24uL步骤②得到的混合液，得到N个PCR反应管，向上述N个PCR反应管内按顺序依次分别加入阴性对照、待检DNA模板和阳性对照各luL；

④在上述步骤③得到的反应管中再分别加入30uL LAMP反应稳定液，盖紧管盖并做好标记，2000转/分钟离心5秒；

⑤在63℃下恒温反应30分钟；

3）显色检测：

取出经步骤2）的反应管，冷却至室温，2000转/分钟离心5秒，按照阴性对照、待检样品和阳性对照的顺序依次分别加入l uL LAMP反应显色液，轻轻混匀，直接用肉眼观察颜色变化或1.5%琼脂糖凝胶进行电泳后用溴化乙锭染色后进行观察。