[发明专利]小泛素样修饰的生物检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小泛素样修饰的生物检测方法。

背景技术

小泛素样修饰是一种广泛存在于细胞内的蛋白质翻译后修饰行为。异常小泛素样修饰会导致神经退行性疾病、癌症、心脑血管疾病等多种疾病的发生。虽然小泛素样修饰调控了细胞内一系列关键生物学行为，但是在胞内目标蛋白中仅有一小部分发生小泛素样修饰，通常这一比例小于5%（参Creton,S.;Jentsch,S.Cell 2010,143,848-848e1）。这种低丰度的现状极大限制了对小泛素样修饰的检测及生物学功能的研究。

传统的主要是利用蛋白质印迹的方法来进行小泛素样修饰的鉴定。通常利用免疫沉降方法来富集被小泛素样蛋白修饰的靶标，然后再利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离，接着进行转膜、封闭、抗体孵育、显影等多个步骤进行小泛素样修饰的鉴定（参Sarge,K.D.;Park-Sarge,O.K.Methods Mol Biol 2009,590,265-77）。然而蛋白质印迹法需要进行一系列实验操作，实验步骤多，实验周期长，且所使用抗体的滴度和特异性对实验结果的影响较大，灵敏度不高，不利于广泛应用。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速、灵敏的小泛素样修饰的生物检测方法。

一种小泛素样修饰的生物检测方法，包括如下步骤：

扩增小泛素样修饰蛋白基因，在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因；

将2.5微克所述融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞内，并在细胞内共表达，得到含有小泛素样修饰蛋白-绿色荧光蛋白及目标蛋白的细胞，其中，所述细胞是人胚肾细胞、人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、非洲绿猴SV40转化的肾细胞或人成骨肉瘤细胞；

将目标蛋白特异性的抗体与用蛋白A/G偶联的树脂进行孵育处理，制备抗体-树脂复合物；

加入裂解液并破碎所述细胞，得到的细胞裂解液离心后取上清液；

向所述抗体-树脂复合物中加入所述上清液，孵育，使目标蛋白与所述目标蛋白特异性抗体结合，接着清洗所述抗体-树脂复合物，之后使用与抗体-树脂复合物等体积的pH2.6的浓度为0.1mol/L的甘氨酸溶液洗脱所述抗体-树脂复合物，得到洗脱液；

对所述洗脱液使用Tris缓冲液稀释100至500倍，得到稀释液；

使用全内反射荧光显微镜在488nm激光器激发的条件下对所述稀释液进行单分子检测，若观察到有荧光分子表明目标蛋白发生小泛素样修饰；若没有观察到荧光分子则表明目标蛋白没有发生小泛素样修饰。

在其中一个实施例中，所述将融合体基因与等量的目标蛋白基因转染进细胞是使用脂质体转染法。

在其中一个实施例中，所述破碎细胞的步骤是将被裂解液重悬后的细胞置于超声波细胞粉碎机中，在35-40W的功率下，按照5s破碎-10s休息-5s破碎的进行1min。

上述小泛素样修饰的生物检测方法在破碎细胞并免疫沉降收集目标蛋白之后即洗脱并进行观察，实验步骤大大减少，可以缩短实验时间；此外，由于全内反射荧光显微镜只是在盖玻片上100nm范围内激发荧光分子，具有极高的灵敏度，因此可以对小泛素样修饰进行单分子水平上的检测，因此具有迅速、灵敏的特点。

附图说明

图1为一实施方式的小泛素样修饰的生物检测方法的流程图；

图2为小泛素样修饰蛋白-1与绿色荧光蛋白基因融合体酶切鉴定图，其中泳道1是pUC Mix Marker(MBI公司)，泳道2是基因融合体双酶切产物；

图3为p53蛋白小泛素样修饰单分子检测结果图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对小泛素样修饰的生物检测方法作进一步详细的说明。

如图1所示，一实施方式的小泛素样修饰的生物检测方法包括如下步骤：

步骤S110，构建小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因的融合体基因，具体包括如下步骤：

首先使用PCR技术扩增小泛素样修饰蛋白基因；然后在限制性内切酶的作用下，通过体外连接反应，将扩增的小泛素样修饰蛋白基因整合进含有绿色荧光蛋白基因的载体中，使得小泛素样修饰蛋白基因与绿色荧光蛋白基因融合在一起，从而得到含有小泛素样修饰蛋白基因-绿色荧光蛋白基因的融合体基因。