[发明专利]检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法

权利要求书

1.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的引物，其特征在于，其组成为：

检测分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对，其中一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；另一对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

鉴别副结核分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；

鉴别鸟分枝杆菌的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No.13和SEQ ID No.14所示。

2.一组检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸的组成为：

核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的检测分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.3所示的PCR扩增产物；

核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.4和SEQ ID No.5、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的鉴别结核分枝杆菌复合群的两组引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.6、SEQ ID No.9所示的PCR扩增产物；

核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示的副结核分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.12所示的PCR扩增产物；

核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的鉴别鸟分枝杆菌的引物对和作为阳性对照的序列如SEQ ID No.15所示的PCR扩增产物。

3.一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

检测分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；

检测分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；

鉴别结核分枝杆菌复合群的第一上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.4所示；

鉴别结核分枝杆菌复合群的第一下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.5所示；

鉴别结核分枝杆菌复合群的第二上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.7所示；

鉴别结核分枝杆菌复合群的第二下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.8所示；

鉴别副结核分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10所示；

鉴别副结核分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示；

鉴别鸟分枝杆菌的上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.13所示；

鉴别鸟分枝杆菌的下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.14所示；

dNTP；

MgCl₂；

Pfu快速高保真聚合酶；

双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：携带有分枝杆菌属特异性16s rRNA的序列、结核分枝杆菌复合群的特异性序列IS6110、IS1081、副结核分枝杆菌的特异性序列f57基因和鸟分枝杆菌的特异性序列IS1245的质粒DNA，所述特异序列依次如序列表SEQID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示。

4.一种检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC方法：

（1）采集样品并提取核酸；

（2）对提取的核酸进行PCR扩增，其中：

PCR的反应体系为：

序列如SEQ ID No.1所示的引物：10μmol/L，0.6μL；

序列如SEQ ID No.2所示的引物：10μmol/L，0.6μL；

序列如SEQ ID No.4所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.5所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.7所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.8所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.10所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.11所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.13所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

序列如SEQ ID No.14所示的引物：10μmol/L，0.5μL；

PCR缓冲液：10×，3μL；

MgSO₄：25mmol/L，1.8μL；

dNTP：2mmol/L，3μL；

KOD-Plus：1U/μL，0.6μL；

模板：5μL；

双蒸水：11.4μL；

总计：30μL；

PCR的反应条件为：

第一步：95℃2分钟；第二步：95℃5秒，62℃5秒，68℃5秒，40个循环；第三步，72℃1分钟；

（3）对扩增产物进行DHPLC检测；阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为分别携带有如序列表SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.12和SEQ ID No.15所示的序列的质粒DNA；

（4）分析、判定结果：样品的洗脱峰与阳性对照的洗脱峰位置一致，且阴性对照无相应的洗脱峰，则样品为阳性。