[发明专利]一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法

权利要求书

1.一株阿魏酸酯酶高产菌株，其保藏号为CGMCC No.5612。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：该菌株为绿色木霉菌株，该其16S核糖体DNA即16S rDNA的基因序列如Seq ID No:1所示。

3.一种利用权利要求1所述菌株生产阿魏酸酯酶的方法，主要包括绿色木霉菌液体发酵以及阿魏酸酯酶的提取分离和纯化步骤，其特征在于：在绿色木霉菌液体发酵中应用阿魏酸酯酶产生和积累诱导工序，

所述的阿魏酸酯酶产生和积累诱导工序具体步骤如下：

A.诱导因子筛选：

从阿魏酸衍生物、维生素类生长因子、酶系的调控方面筛选诱导因子，诱导因子选自维生素类或阿魏酸衍生物或诱导离子或其他它诱导因子或其混合物；

B．诱导因子使用方法：

维生素类或阿魏酸衍生物或诱导离子添加入发酵培养基中，结合中期补加碳源和氮源，用于诱导和促进产生阿魏酸酯酶。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述诱导因子中的诱导离子选自硼离子或镁离子或钴离子或钼离子中的一种或几种的混合物；维生素类选自维生素B或叶酸；阿魏酸衍生物为阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯；其它诱导因子为甲壳素或壳聚糖或米糠或麸皮中的一种或几种的混合物。

5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）绿色木霉菌液体发酵：

A.菌种活化；

B.液体种子制备；

C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法获得含阿魏酸酯酶的发酵液；

其中发酵过程：将液体种子以2-10v/v%的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加0.5-1w/v%的碳源物质以及0.05-0.2w/v%的氮源物质；

（2）阿魏酸酯酶的制备：

A.固液分离：将上述发酵的含阿魏酸酯酶的发酵液经固液分离后，清液用于制备阿魏酸酯酶；

B.发酵清液采用微滤脱除胶质以及不溶性颗粒，经超滤膜浓缩后，添加保护剂，经喷雾干燥得到阿魏酸酯酶粗品。

6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）绿色木霉菌液体发酵：

A.菌种活化；

B.液体种子制备；

C.发酵：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用液体深层发酵方法获得含阿魏酸酯酶的发酵液；

其中发酵过程：将液体种子以2-10v/v%的接种量接到发酵培养基中，26℃培养48h，补加0.5-1w/v%的碳源物质以及0.05-0.2w/v%的氮源物质；

（2）阿魏酸酯酶的制备：

A.固液分离：将上述发酵的含阿魏酸酯酶的发酵液经固液分离后，清液用于制备阿魏酸酯酶；

B.将上述步骤A获得的清液，采用微滤脱除胶质以及不溶性颗粒，经超滤膜浓缩后，用盐析的方法，得到阿魏酸酯酶粗酶，再复溶后，配制成0.5-2w/v%的酶液，经柱层析纯化，超滤脱盐后，冷冻干燥得到阿魏酸酯酶纯品。

7.根据权利要求5或6所述制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的固液分离为板框过滤或三足式离心机离心或碟片式离心机离心；所述的步骤（3）中微滤膜的孔径为0.1-0.5μm，超滤膜的孔径为截留物质的分子量2000-10000Dalton；所述的盐析介质是氯化钠或硫酸钠或硫酸镁或硫酸铵溶液。

8.根据权利要求5或6所述制备方法，其特征在于：所述的步骤（3）中柱层析采用的是离子交换层析，使用的层析介质为DOWEX MXA-1或Q-Sepharose FF或DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose FF或717强碱性离子交换树脂或D201大孔强碱性阴离子交换树脂。