[发明专利]糖肽

说明书

本申请为申请号200880101043.1、申请日期2008年7月30日、发明名称“肽的制备方法”的分案申请。

【技术领域】

本发明涉及肽和糖肽的制备方法。

【背景技术】

作为肽的制备方法，适用的有连接法。其中，自然化学连接法（Native Chemical Ligation、NCL法）是可以制备在连接部位（Ligation部位）具有天然酰胺键（肽键）的肽的方法。NCL法也可以在无保护的肽链之间进行，并且已知是用于在连接部位生成天然酰胺键的有效的方法（例如，专利文献1）。NCL法如下图所示，该方法是使第1肽与N末端上具有半胱氨酸残基的第2肽进行化学选择反应，以便使得在C末端上具有α羧基硫代酯部分，这时，半胱氨酸的侧链硫羟基（SH基，也称为巯基）选择性地与硫代酯基的羰基碳反应，通过硫羟基交换反应，生成硫代酯键的初期中间体。该中间体自发地发生分子内转位，在连接部位形成天然酰胺键，另一方面，使其再生半胱氨酸侧链硫醇。通过采用该反应，可以高效地合成各种各样的多肽。

自然化学连接法

典型的NCL法的主要缺点是，该方法中，所连接的2个肽断片中的一个必须在N末端上具有半胱氨酸残基，连接后得到的肽也在连接部位具有半胱氨酸残基。因此，当在想要通过合成获得的所希望的肽中不存在半胱氨酸残基时，就不能采用该方法。

另外，在典型的NCL法中，采用例如固相合成法等来准备想要连接的2个或者2个以上的肽断片，但当象例如生物体内存在的肽那样，半胱氨酸含量非常少时（或者不存在半胱氨酸时），为了供给NCL法，必须准备非常长的肽断片，因此不能说是有效率的。

另一方面，已知在生物体内存在各种各样的糖肽和糖蛋白质。这些糖肽或者糖蛋白质的糖链可分为N键型和O键型这2种类型。N键型糖链一般是与天冬酰胺侧链的酰胺氮形成N-糖苷键的糖链，通常在天然的状态下，常常与称为-Asn-X-Ser/Thr-（式中，X为脯氨酸以外的氨基酸）。的共有序列(consensus sequence)中的Asn键合。O键型糖链为在丝氨酸或者苏氨酸侧链的羟基中形成O-糖苷键的糖链。下面示出其一例（Gal：半乳糖、GlcNAc：N-乙酰基葡糖胺、Man：甘露糖、Fuc：岩藻糖、GalNAc：N-乙酰基半乳糖胺）。已知具有O键型糖链的天然糖肽中，脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的含有率高（非专利文献1和2）。

N键型糖链和O键型糖链的例子

【专利文献1】国际公开WO96/34878号

【非专利文献1】TRENDS in biochemical sciences，Vol.27，No.3，March 2002

【非专利文献2】Cancer Biology & Therapy 6：4，481-486，April 2007

【发明内容】

【发明所要解决的课题】

本发明的课题是提供肽和糖肽的新的制备方法。

特别地，在以往典型的NCL法中，连接在一起的2个肽断片中的一个在N末端必须具有半胱氨酸残基，而且，连接后获得的肽也在连接部位具有半胱氨酸残基，因此，想要将最终得到的所希望的肽（或者糖肽）中的半胱氨酸残基作为连接部位，只能设计并使用NCL法。因此，本发明提供一种可以设计连接法的肽和糖肽的新的制备方法，该方法除了能以想要获得的所希望的肽中的半胱氨酸残基作为连接部位以外，还能以与丝氨酸残基或苏氨酸残基相对应的部分作为连接部位。

更具体地，根据本发明的一个方案，可以将肽（或者糖肽）中的半胱氨酸残基转变成丝氨酸残基。因此，可以通过采用NCL法将在N末端上具有半胱氨酸残基的肽与其他的肽连接，然后，将该半胱氨酸残基转变成丝氨酸残基。因此，根据本发明，即使想要获得的所希望的序列中不存在半胱氨酸残基，但是只要存在丝氨酸残基，也可以将该位置作为NCL法中的连接部位来设计。

另外，根据本发明的一个方案，可以将在N末端上具有-SH基的苏氨酸衍生物（或者该-SH基被二硫键等保护的苏氨酸衍生物）残基通过利用连接法将N末端上具有的肽与其他的肽连接起来，然后，将获得的苏氨酸衍生物残基转变成苏氨酸残基。因此，根据本发明，即使在想要获得的所希望的序列中不存在半胱氨酸残基，但是只要存在苏氨酸残基，也可以将该位置作为连接法中的连接部位来设计。

这样，本发明提供一种能够将糖肽中丰富存在的丝氨酸或苏氨酸作为采用连接法的连接部位来设计的、采用连接法的肽和糖肽的新型的制备方法。