[发明专利]一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法

权利要求书

1.一种将固氮菌引入甘蔗组培苗的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养；

利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理；

测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态；

用荧光显微镜检测克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组织体内的定殖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在无菌操作的条件下切取甘蔗的茎尖，并依次进行愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养的实现方法为：

在无菌操作的条件下切取以上两个甘蔗品种的茎尖以上约2-4cm处的顶端分生组织接到添加3.0mgL^-1 2，4-D的固体MS培养基上诱导愈伤组织；

在完全黑暗的条件下培养30天后再把愈伤组织接到添加2.0mgL^-16-BA和0.2mgL^-1NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养；

分化苗再用添加3.0mgL^-1NAA和2.0mgL^-1IBA的固体MS培养基上诱导生根，生根后再转入添加有1.0mgL^-1NAA和1.0mgL^-1IBA的液体MS培养基上进行壮苗培养。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导、苗分化培养、诱导生根及壮苗培养时的的传代培养周期均为30天。培养条件为白天28℃培养16小时，晚上25℃培养8小时，光照强度为2000Lx，固体MS培养基在进行121℃、20min的高压灭菌前，将pH值调到5.8。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用克雷伯氏菌的标记菌株制备菌悬液，并对甘蔗的组培苗进行接菌处理的实现方法为：

将克雷伯氏菌的标记菌株在LB液体培养基中培养，在37℃、200r/min条件下过夜培养至LB液体培养基浑浊；

取10μl菌悬液到50ml加有抗生素的LB液体培养基中，在37℃、200r/min条件下过夜培养至在600nm下的吸光度为0.8左右；

在4000×g、10min、4℃的条件下，离心收集菌体，用无菌的pH值为7.4的磷酸缓冲液悬浮至10¹²CFU/ml，再用磷酸缓冲液稀释，获得一定浓度的菌悬液；

把已生根的甘蔗组培苗在超净工作台中分成单株，转到装有50ml不含维生素的1/10MS液体培养液的500ml培养瓶中，并加入一定浓度的菌悬液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基包含10gL^-1蛋白胨、5 gL^-1酵母提取物、5gL^-1NaCl，并且在对LB液体培养基高压灭菌前将pH值调到7.0。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测定克雷伯氏菌的标记菌株在甘蔗组培苗体内的定殖动态的实现方法为：

取甘蔗组培苗分为根、叶鞘、和叶片三部分或根和苗两部分先在75％酒精中浸泡30s，再用1％的次氯酸钠表面消毒1min，然后用无菌水漂洗4次，每次1分钟；

用无菌滤纸轻轻吸干甘蔗组培苗上选取部分的水分后分别称取质量；

将甘蔗组培苗吸干水分的部分放到灭过菌的研钵中研磨成匀浆后加9ml灭菌的磷酸缓冲液混匀并转移到无菌的试管中，混匀后用无菌水进行10倍系列稀释，进行根、叶鞘和叶片内克雷伯氏菌标记菌株的分离；

取菌悬液100μl加到含有抗生素的LB平板中，均匀涂布后用封口膜封好，放到37℃的培养箱中倒置培养24小时后进行计数。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，克雷伯氏菌标记菌株分离用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的固体LB培养基。