[发明专利]一种用于多不饱和脂肪酸生物合成的脱饱和酶Δ9 Des

说明书

技术领域

本发明涉及多不饱和脂肪酸（(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的微生物制造领域，具体涉及在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起作用的脂肪酸脱饱和酶。 

背景技术

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有两个或两个以上双键、碳原子数为16～26的直链脂肪酸。其中，ω-3和ω-6是两类人体所必需的脂肪酸，不能在体内合成，只能通过食物摄取。属于ω-3的有：α-亚麻酸(ALA,18:3)、二十碳五烯酸(EPA,20:5)、二十二碳六烯酸(DHA,22:6)等；属于ω-6的有：亚油酸(LA,18:2)、γ-亚麻酸(GLA,18:3)和花生四烯酸(ARA,20:4)等。多不饱和脂肪酸ω-3和ω-6在人体内有着多方面重要的生理功能，是所有细胞膜的重要组成成分，对激素代谢和许多酶的活性起调控作用，特别对新生儿脑和视力的发育是必需的。 

PUFAs的生物合成途径是以硬脂酸(Stearic acid)为底物，主要通过脂肪酸脱氢酶(Desaturase,Des)和延长酶(Elongase,Elo)的作用，生成不同的脂肪酸产物。主要的脂肪酸合成途径有三条：Δ6脱氢酶-Δ6延长酶-Δ5脱氢酶-Δ5延长酶-Δ4脱氢酶途径(Δ6 Des-Δ6 Elo-Δ5 Des-Δ5 Elo-Δ4 Des), 

Δ9延长酶-Δ8脱氢酶途径(Δ9 Elo-Δ8 Des)和聚酮合成酶途径(Polyketide synthase,PKS)。研究PUFAs生物合成途径中的关键酶和节点，对其合成通路进行解析和改造，对于PUFAs的微生物制造具有重要意义。 

高山被孢霉(Mortierella alpina，M.alpina)是目前产PUFAs真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种(GRAS)，其PUFAs含量极为丰富，总的脂肪含量达到菌体生物量的50%，其中ω-3达到总脂肪酸含量的3%，而ω-6 达到总脂肪酸含量的近30%，是名副其实的油脂细胞工厂。目前已有M.alpina菌株用于ω-6脂肪酸花生四烯酸(ARA,20:4)商业化生产的报道。已知M.alpina编码1个c5，两个c6,3个c9,1个c12和1个ω3区位选择性脱氢酶，其具备所有已知的区位选择性膜脱氢酶组。 

发明内容

膜脱饱和酶可以在多种宿主中表达，例如大肠杆菌、啤酒酵母、米曲酶和高山被孢霉。申请人已经对PUFAs生物合成途径中的关键酶(ω3 Des、Δ12 Des和Δ9-I Des)的高效表达、纯化和鉴定进行了大量工作。具体地，申请人在M.alpina全基因组测序的基础上，设计了三对分别针对编码M.alpineΔ9 Des、Δ12 Des和ω3 Des这三个脱饱和酶的核苷酸的引物，具体引物序列在表1中列出。提取高山被孢霉RNA后进行反转录得到cDNA，用FF1和FR1、FF2和FR2、FF3和FR3三对引物PCR扩增出三条序列，将其插入pET19b(PP)并测序，进而亚克隆至毕赤酵母表达载体pPinkα-HC，构建上述三个脱饱和酶的表达载体，线性化后电转化至pPink strain2，得到的重组菌能够顺利表达上述三种脱饱和酶。酶学活性分析结果表明重组菌中的脱饱和酶能够发挥功能，并用Ni柱一步层析法得到纯化的脱饱和酶蛋白。 

本发明提供了编码M.alpinaω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)的基因，其核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示。 

本发明还提供了分别含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的表达载体，能够分别表达M.alpineω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述表达载体是毕赤酵母表达载体。 

本发明还提供了一种重组微生物，它能够分别表达M.alpinaω3脱饱和酶(FADS15)和Δ9脱饱和酶(FADS9-I)。优选地，所述重组微生物是重组毕赤酵母，包括PichiaPink strain 1、PichiaPink strain 2、PichiaPink strain 3和PichiaPink strain 4菌株，特别是PichiaPink strain 2，其中含有携带SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的毕赤酵母表达载体。