[发明专利]一种高繁殖能力猪圆环病毒2型毒株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒学领域，具体涉及一种利用病毒分子遗传学技术改造获得的高繁殖能力的猪圆环病毒2型新毒株及其在制备灭活疫苗中的应用。

背景技术

根据猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)的致病性、抗原性及核苷酸序列，可将其分为两个基因型，即猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)。

PCV2是近十年新出现的一种可引起猪圆环病毒病(Porcine circovirus virus-associated disease，PCVAD)的病毒。PCV2对猪的致病性以免疫系统的损伤为特征，使感染猪处于严重免疫抑制状态，临床上主要表现为消瘦、淋巴结肿大等病变，与多种病原混合感染还可导致多系统衰竭、呼吸困难、繁殖障碍等。

猪圆环病毒属圆环病毒科圆环病毒属。在电镜下，PCV2是一种无囊膜的呈二十面体对称的圆形小颗粒病毒，直径17nm，具有单股环状的DNA基因组。对氯仿、碘酒、酒精等有机溶剂不敏感，可在70℃稳定存活15分钟。但对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂等试剂较敏感。

目前已发现1768、1767个核苷酸组成的不同基因组大小的PCV2毒株，二者的核苷酸同源性在90％以上。PCV2基因组研究可将PCV2分为PCV2a、PCV2b和PCV2c三个基因亚型，三型之间基因组核苷酸和氨基酸同源性均在95％左右。

PCV2基因组含有11个阅读框，即ORF1～ORF11，各阅读框大小相差悬殊。其中ORF1、ORF5、ORF7、ORF10的5’-3’方向相同，ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11的5’-3’方向相同，这些阅读框表现为基因部分重叠，可充分利用圆环病毒有限的遗传物质。

近来年，PCV成为国内外学者的研究热点，很多学者采用不同方式构建了PCV1及PCV2的感染性克隆，并将其拯救出的重组病毒应用于相关研究中。授权公告号为CN101423836B的中国发明专利公开了一种猪圆环病毒1型感染性克隆及其所拯救的病毒和应用，该发明将猪圆环病毒1型的2个基因组顺式连接插入到pUC19载体中构建获得感染性分子克隆，并在该感染性克隆中插入Sal I酶切位点作为分子靶标，所拯救出的重组病毒带有分子靶标，可用PCR结合RFLP将其与亲本病毒相鉴别，并将该拯救病毒用于制备检测猪圆环病毒1型抗体的试剂或药物中。

目前，PCV2感染引起的猪圆环病毒病给全球养猪业造成巨大损失，病毒感染产生的免疫抑制能够导致现有疫苗免疫失败，造成多种病原混感，并使疫病流行更加严重。采用疫苗免疫已成为控制PCV2相关疾病的关键，是减少经济损失的有效方法。PCV2体外培养时病毒滴度低，是疫苗价格高昂的根本原因，也是当今疫苗研制的最大障碍。

发明内容

本发明提供了一种具有高繁殖能力(高滴度)的猪圆环病毒2型新毒株，解决了现有PCV2毒株繁殖能力差，应用于开发疫苗成本高的问题。

一种猪圆环病毒2型毒株，命名为猪圆环病毒2型ZJ/H株，简写为PCV2-ZJ/H株，该毒株于2012年7月17日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6391。

所述猪圆环病毒2型毒株通过方法制得：

(1)以PCV2-HZ0201病毒的基因组DNA为模板，以FSAC和RSAC为引物扩增PCV2全基因序列，然后凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物，连接到质粒pMD18-T，转化Top10感受态细胞，获得重组质粒pMD-HZ0201。

FSAC：GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT

RSAC：GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA

(2)以构建好的pMD-HZ0201质粒为模板，利用核苷酸缺失特异性引物进行Dpn I定点诱变扩增，然后凝胶纯化回收试剂盒纯化PCR产物，连接到质粒pMD18-T，转化Top10感受态细胞，获得重组质粒pMD-ZJ/H。

(3)经过序列测定正确的pMD-ZJ/H重组质粒，用限制性内切酶Sac II酶切，用T4DNA连接酶环化，再将环化质粒用lipofectamine^TM 2000转染PK-15细胞，收获病毒粒子的细胞培养物。