[发明专利]定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂盒。

背景技术

许多疾病具有外周血嗜酸细胞增多的表现，其中绝大多数都是由于感染、变态反应及自身免疫性疾病引起的反应性增多，个别情况下为克隆性的血液系统恶性疾病，鉴别诊断对于这些患者的确诊及随后的治疗都十分必要。具有嗜酸细胞增多表现的髓系增殖性肿瘤（MPN）中一部分涉及血小板衍化生长因子受体α（PDGFRA）基因异常，其最常见的异常类型为具有FIP1样基因1-血小板衍化生长因子受体α（FIP1L1-PDGFRA）融合基因。除了MPN之外，FIP1L1-PDGFRA融合基因亦见于个别具有嗜酸细胞增多表现的急性髓性白血病及T细胞淋巴瘤中。染色体4q12缺失导致形成FIP1L1-PDGFRA融合基因，由于其异常隐匿，因此常规的染色体核型分析不易检测到，有必要采用PCR或FISH技术检测该融合基因来确定。2008版WHO血液恶性肿瘤诊断标准中已提出，检测到FIP1L1-PDGFRA融合基因即可以做出髓系恶性肿瘤的诊断。

确定FIP1L1-PDGFRA融合基因的另一个意义在于其形成导致酪氨酸激酶PDGFRA处于持续活化状态。该作用机制类似于慢性髓性白血病中BCR-ABL融合基因的形成导致ABL酪氨酸激酶持续活化。近十年来，以伊马替尼为代表的人工合成小分子靶向药物——酪氨酸激酶抑制剂已广泛应用于慢性髓性白血病的治疗，目前已成为其一线治疗选择。而酪氨酸激酶PDGFRA是伊马替尼的另一个靶点，临床研究已证明小剂量或间断使用伊马替尼可以使FIP1L1-PDGFRA（+）的慢性嗜酸细胞白血病、急性髓性白血病及T细胞淋巴瘤患者很快获得血液学缓解甚至分子缓解。因此对于临床表现为嗜酸细胞增多的患者很有必要进行FIP1L1-PDGFRA融合基因的筛查，此外为了评价疗效，监测微小残留病，很有必要定量而敏感地检测FIP1L1-PDGFRA融合基因水平。

目前，常用的PCR技术检测FIP1L1-PDGFRA融合基因的方法往往是定性PCR后根据PCR产物电泳结果判断是否阳性。由于FIP1样基因1（FIP1L1）在DNA水平的断裂点不固定，目前已有报道显示涉及外显子9—13，PDGFRA基因断裂点基本在外显子12上，但是断裂点也往往不同，因此电泳条带大小不固定，为鉴别是否为特异性的PCR产物，还需要通过测序来确定，从而导致PCR过程较为繁琐。此外，定性PCR不能得出定量的结果，所以无法满足当前微小残留病检测的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于定量检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA水平的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有实时定量PCR检测FIP1L1-PDGFRA融合基因mRNA的上游引物I、下游引物I和TaqMan探针I；

所述上游引物I为序列表序列1、2、3、4和5所示五种单链DNA中的至少一种；所述下游引物I为序列表序列6和7所示两种单链DNA中的至少一种；所述TaqMan探针I为序列表序列8和9所示两种单链DNA中的至少一种。

在上述试剂或试剂盒中，还可含有实时定量PCR检测内参基因ABL mRNA的上游引物Ⅱ、下游引物Ⅱ和TaqMan探针Ⅱ；

所述上游引物Ⅱ为序列表序列10所示的单链DNA；所述下游引物Ⅱ为序列表序列11所示的单链DNA；所述TaqMan探针Ⅱ的核苷酸序列如序列表序列12所示。

在上述试剂或试剂盒中，还可含有用于制作标准曲线的标准品；所述标准品具体可为含有序列表序列13中第142-265位所示的核苷酸序列的质粒标准品。

在上述试剂或试剂盒中，所述TaqMan探针I和Ⅱ的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

在上述试剂或试剂盒中，还可含有独立包装的荧光PCR的Master Mix。

在上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒中还可含有阳性对照和/或阴性对照。

本发明采用基于TaqMan探针的实时定量PCR技术来检测常见类型的FIP1L1-PDGFRA mRNA水平，具有如下优点：

1）准确而特异：由于采用了基于TaqMan技术的实时定量PCR技术检测，保证了特异性扩增。