[发明专利]一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法，属于生物工程技术领域。 

(二)背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)能及时有效地清除机体内的超氧自由基，使生物体能够避免氧化损伤，是生物体抵御活性氧毒害作用的第一道防线，具有抗辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症等功能。目前SOD酶已作为一种保健医药产品广泛应用于医药、食品、饮料、化妆品等行业，具有非常广阔的市场。 

市场上流通的SOD大多是从动物血液中提取的，容易受到污染，产生细菌内毒素，引起热源性问题，研制开发重组人超氧化物歧化酶不仅可解决人源SOD来源有限和因血制品污染而带来的安全性问题，而且可避免异源SOD在临床应用时可能出现的免疫性过敏反应。传统的SOD纯化方法较繁琐且费时费力，SOD产率较低、生产成本昂贵，不利于大规模的工厂化生产。因此开发其他更安全、更经济的提取或分离方法取代传统SOD生产方法具有十分重要的意义。本发明将含有人源SOD基因的工程菌进行发酵表达，高压匀质破碎后进行热变性，离心超滤后进行层析，克服了以现有技术存在的缺陷，可满足工业化生产的需要。 

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单，适用于工业化生产的重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。 

(四)技术方案 

本发明涉及一种重组人源超氧化物歧化酶的生产方法。属于生物工程技术领域。该方法利用铜盐热变性除去大部分杂蛋白，离心后经过微滤除菌及杂质，利用超滤进行浓缩、除盐及小分子杂蛋白，阴离子层析纯化后，冷冻干燥。操作简单，成本低廉，适用于工业生产。 

具体操作步骤为： 

(1)将含有人源超氧化物歧化酶基因的大肠杆菌进行发酵，发酵液用管式离心机离心，转速：16000r/min，流速：0.6-0.8mL/min，收集菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次； 

(2)在破碎后混合液中加入2％-6％体积的10mmol/L的CuCl₂溶液，通入螺旋管加热器中进行热变性，热变性温度65-80℃，时间：10-30min。离心，收集上清； 

(3)膜处理，将步骤2所得上清液依次通过5μm的预处理膜、0.22μm滤膜、6kDa超滤膜； 

(4)DEAE-SephadexA50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行 梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，冷冻干燥，用邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。 

附图说明：

图1是本发明实施例1中CuCl₂浓度对SOD活性影响的示意图； 

图2是本发明实施例2中热变性温度及时间对SOD活性的影响的示意图。 

(四)具体实施方式

下面通过具体实例应用，对本发明的技术方案进行进一步的说明。 

实施例1： 

将60L发酵液用管式离心机离心，转速：16000rpm，流速0.6-0.8mL/min，收集发酵后的菌体，按照菌体湿重与纯水体积1∶10比例悬浮，用高压匀质机破碎，破碎压力为880bar，破碎一次。在破碎后混合液中分别加入2％、3％、4％、5％、6％体积的10mmol/L的CuCl₂后通入螺旋管加热器中，65℃，20min。离心后，弃去沉淀。上清液进行膜处理，首先通过5μm预处理膜除去杂质，细胞碎片；然后过0.22μm滤膜，除去杂菌；最后用6kDa的超滤膜进行处理，除盐及小分子杂蛋白，浓缩至15L。浓缩液进行DEAE-SephadexA50柱层析，用2.5-50mmoL/L的pH 7.6的磷酸钾盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活力的洗脱液，超滤浓缩后，将所得溶液冷冻干燥得到SOD精品。从图1中可以看出SOD活性可达到2700U/mg以上。 

实施例2：