[发明专利]适用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基及方法

说明书

本发明公开了一种造用于Vero细胞微载体悬浮放大培养的培养基，包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类，缓冲成分和添加物。通过上述方式，本发明能够不仅适合在添加痕量血清情况下Vero方瓶静置培养和滚瓶培养，也支持微载体悬浮培养和反应器微载体放大培养，还可以作为无血清病毒维持液实现无血清病毒生产。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及一种用于支持Vero细胞贴壁生长和支持病毒增殖的培养基和使用方法，更具体地说是用于Vero细胞微载体悬浮培养及微载体悬浮规模放大培养的培养基及利用该养基实现规模化培养的方法。

背景技术

Vero细胞来源清晰，历史清楚，一定代次内无致瘤性，是世界卫生组织(WHO)和我国生物制品规程批准可用于人类和兽类疫苗生产的细胞系，是现阶段病毒疫苗生产最主要的细胞基质。Vero细胞对多种病毒敏感，且病毒增殖滴度高。目前国内各种以Vero细胞为生产介质的生物制品产业蓬勃发展，越来越多的企业已达到了商业化生产的要求，这就需要大量可供生产用的细胞培养基，同时也亟需一定规模的体外培养。

然而，大多数传统培养基需要添加10％左右的牛血清，血清购买和储存的成本高，更重要的是，添加高浓度的血清大大增加了下游产品纯化的压力。血清组分的复杂性及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，增加了产品生产的不稳定性和产品质量控制的难度。不可否认，使用无血清培养基是避免以上风险的较好途径，国外也已有多种商品化的Vero细胞无血清培养基上市，如JRH公司的EX-CELLTMVERO，Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro SFM等。但无血清培养基售价高，供货期长，对企业来说增加了大量成本，降低了其市场竞争力；另外，细胞由含血清培养基转入无血清培养基存在适应过程，需要根据细胞株的特性尝试不同的无血清培养基产品，细胞无血清适应需要4～5代的时间，一般情况下细胞在无血清培养基中培养8代后，生长会变慢。无血清细胞库的建立也是一个难题。

当涉及反应器微载体系统的规模放大，采用无血清培养基的生产路线将面临更大的问题。贴壁依赖型细胞的放大需要胰蛋白酶的消化，去除了血清，如何中和培养基中的胰蛋白酶是技术人员要迫切解决的。现在常用的方法是添加植物来源的胰蛋白酶抑制剂，如大豆胰蛋白酶抑制剂。但是，胰蛋白酶抑制剂容易失活，储存条件苛刻；更重要的是大量使用胰蛋白酶抑制剂成本上是不允许的。另外，长时间使用胰酶抑制剂会抑制细胞的生长。

降低细胞生长阶段的血清添加量，优选的将血清浓度降至痕量(1％(v/v)以下)应该是可行的方法。本发明通过提供一种低成本细胞培养基解决了现有的技术问题。即Vero细胞生长阶段添加痕量血清，可支持Vero在方瓶、滚瓶上生长，并可支持Vero细胞微载体悬浮培养和微载体悬浮规模放大培养。另外本培养基可以作为病毒维持液，实现病毒无血清生产。

基于微载体细胞培养生产疫苗的工艺规模已达到1000L以上[1-5]。反应器放大到下一级反应器的基本转移模式有消化转移和球转球。

球转球是指微载体上的细胞汇合成单层后，按一定比例加入新的微载体，并采取某些措施(如低转速搅拌、间歇搅拌等)促使细胞从旧微载体向新微载体迁移而实现放大。球转球放大过程可以直接在原反应器中添加新微载体，使微载体浓度增大；也可以将长有细胞的旧球打入下一级反应器中，加入新微载体后用新鲜培养基稀释微载体至原来浓度。虽然已有学者报道了球转球放大的成功案例[6]，但要求细胞的迁移能力强，而且旧球上的细胞容易长得过老，因此限制了其广泛应用。