[发明专利]一种 N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯核酸适体及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种能够与N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯发生高亲和力和特异性结合的核酸适体及其筛选方法和应用。 

背景技术

铜绿假单胞菌（Pseudomonase aeruginosa，PA）是一种机会感染性致病菌，它对临床上应用的大部分抗生素都具有较强的耐药性，而且其耐药性的发展速度非常快，极易对新型抗生素产生耐药性。 

研究表明，铜绿假单胞菌产生的各种严重感染与其毒力因子的释放密切相关，而铜绿假单胞菌的绝大部分毒力因子的表达都受其群体效应系统（quorum sensing，QS）的正性调控。N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯（N-(3-oxo-dodecanoyl)-l-homoserine lactone，简称OdDHL）是铜绿假单胞菌群体效应系统的信号分子，铜绿假单胞菌在生长过程中，不断向细胞外分泌OdDHL，当细菌周围环境中的OdDHL浓度达到阈值时，便激活铜绿假单胞菌的QS系统，启动细菌毒力基因的表达，增强铜绿假单胞菌的致病性。研究发现，干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统可以抑制细菌毒力，降低其致病性，具有治疗感染的作用。 

目前，国外已经报道了一类可以与OdDHL结合的鼠源性单克隆抗体，亲和力在5nM～150nM之间。这类抗体在体外实验中可结合OdDHL分子，干扰铜绿假单胞菌的QS系统的信号转导，从而可抑制细菌毒力的表达。然而，这类抗体虽然具有治疗铜绿假单胞菌感染的潜在价值，但由于鼠源性抗体对人类来说是一种异种蛋白，如果直接将OdDHL的鼠源性单克隆抗体应用于人体的治疗，人体可产生针对鼠抗的抗体（人抗鼠反应），从而与抗体结合并清除鼠抗，降低其的疗效。而且，直接应用鼠源性抗体还可能会诱发过敏反应，对患者造成损伤。由此，鼠源性抗体需要通过人源化改造后才能应用于人体，但是，鼠源性抗体的人源化改造是一个复杂、费时的过程，对技术要求相当高，而且在改造过程中容易导致抗体亲和力降低，甚至完全丧失，这导致鼠源性抗体应用于治疗的开发逐渐被放弃。 

与抗体相比，核酸适体是通过体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)从DNA/RNA文库中筛选出来的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段（ssDNA或ssRNA），它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标，而且其化学性质稳定，因此，亟需要研究和发展能够特异性抑制铜绿假单胞菌毒性的核酸适体，从而为疾病治疗的临床应用奠定基础。 

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术中的不足之处而提供一种易于制备、节约成本、安全性好的能够与OdDHL高亲和力和高特异性结合的核酸适体。 

本发明的目的之二在于克服现有技术中的不足之处，提供一种上述核酸适体的筛选方法。 

本发明的目的之三在于克服现有技术中的不足之处，提供一种上述核酸适体在制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。 

本发明的目的由以下技术措施实现：

提供一种N-(3-氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯（OdDHL）核酸适体，所述核酸适体为SEQ ID NO:1核苷酸序列所示的DNA分子。

本发明还提供一种上述核酸适体的筛选方法，包括以下步骤： 

(1) OdDHL类似物与载体的偶联 

用冰冷的MES缓冲液配制浓度均为20mg/ml的OdDHL类似物及EDC溶液，将二者加入到用MES缓冲液充分洗涤后的氨基化纳米磁颗粒中，室温下反应2h，OdDHL类似物通过其分子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应，使分子偶联到氨基化纳米磁颗粒的表面；偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHL类似物后，获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒备用；

(2) 随机单链DNA文库的设计

随机单链DNA文库是两端为固定的引物序列、中间为45个碱基的随机序列：5’-GCAATGGTACGGTACTTCC-(N₄₅)- CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3’，其中，N₄₅表示45个随机核苷酸；

(3) 核酸适体的筛选

a）正向筛选

① 随机单链DNA文库的预处理