[发明专利]一种酸激活CSP靶向抗菌肽及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽，具体地，涉及一种酸激活CSP靶向抗菌肽及其制备和应用。 

背景技术

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生的慢性进行性破坏性感染性疾病                                                   。WHO将其列为仅次于心血管病、肿瘤之后的第三大非传染性重点防治疾病。变形链球菌(Streptococcus mutans，SM)是龋病的主要致病菌   ，为革兰氏阳性菌，厌氧或兼性厌氧，抑制其生长可有效治疗龋   。 

变形链球菌以生物膜（SM biofilm）的形式存在并致龋。以生物膜形式存在的细菌与以浮游态存在的细菌相比，在代谢特点和生理现象方面存在着众多明显的不同点，如对抗菌剂的敏感性、基因表达和信号传导、耐酸性等。细菌生物膜对多数抗菌剂有较强的抵抗力，其抗性水平约为浮游态细菌的10¹-10³倍。SM生物膜在红霉素和青霉素浓度为5000倍MIC作用1 h时及浓度为1000倍MIC作用3 h时，未能被完全杀死；在洗必泰浓度为500倍MIC作用1 h及浓度为100倍MIC作用3 h，也未能被完全杀死。类似地，Noiri等发现，牙龈卟啉菌单胞生物膜在160倍MIC浓度的甲硝唑中仍能生长，其耐药机制与单个细菌迥然不同   。细菌生物膜耐药性的增强与其结构特点密切相关：以生物膜形式存在的细菌，其生长速度显著低于浮游态细菌，常处于静止期，不易被常规的抗菌剂杀灭。而且，临床常用的抗菌剂如洗必泰、氟制剂等，还具有副作用并易导致细菌耐药、耐氟。 

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMP)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有独特的抗菌机制、抗菌谱广、种类多、不易产生耐药性等特点。Batoni等报道，AMP主要通过膜攻击途径作用于生物膜内生长缓慢或不生长的细菌，从而抑制细菌及其生物膜的生长。此外，与传统抗生素相比，AMP还具有快速杀灭细菌的动力学特征，将更适用于动态且快速变化的微生物群落(如生物膜)    。但AMP的广谱抗菌性也容易造成菌群失调等不良后果。同时，天然AMP具有生物效能低、筛选难度高、蛋白水解不稳定等缺点。 

特异性靶向抗菌肽(Specifically Targeted AntiMicrobial Peptides, STAMPs) 是一种可设计并具有特异性的AMP，由靶向定位区域、AMP区域和(或)连接体区域组成。靶向定位区通过增高靶细菌表面AMP浓度，使AMP的特异性、杀伤效力和动态性能全面提升   。SM感受刺激多肽(CSP)是SM密度感应系统(quorum- sensing，QS)中的菌种间特异性信号分子   ，具有介导SM进入基因感受态，影响SM的转化突变、遗传性状、粘附聚集等重要作用。Eckert等利用固相合成法将CSP与来自于羊髓的AMP novispirin G10杂合成C16G2，可特异性破坏SM生物膜而将其杀灭，但不影响人口腔中正常菌群的生长，与单独使用novispirin G10相比，其杀伤能力提高了20倍以上，但是表现出了一定的细胞毒性及溶血性   。Melittin是从蜂毒中提取发现的一类高破膜活性的抗菌肽，其对SM细菌的杀伤能力明显强于C16G2   。但是缺乏选择性以及高毒性限制了melittin的临床应用。 

由于变形链球菌是厌氧细菌，因而代谢过程中产生大量的乳酸，从而导致其生存的微环境呈酸性。此外，因而我们利用这一特点，设计了一类酸激活的CSP靶向抗菌肽：用2,3-二甲基马来酸酐（DMMAn）对抗菌肽melittin中赖氨酸的侧链氨基进行保护，从而使抗菌肽失去阳离子特征而降低活性。当pH低于6.8时，DMMAn就可以从氨基上脱掉，使抗菌肽melittin恢复活性；将DMMAn保护的melittin通过二硫键与CSP靶向分子相连，以提高变形链球菌表面melittin的数量。这种新型的CSP靶向抗菌肽即可以通过CSP靶向分子提高抗菌肽的选择性和抗菌肽在SM细菌表面的聚集度，同时又通过DMMAn对氨基的保护而降低了melittin的毒性。当这种CSP靶向抗菌肽进入到龋齿内之后，可被微环境的酸性条件而激活，从而具有杀菌活性。