[发明专利]一种富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法

权利要求书

1.一种富集水产品中隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）样品处理：取水产品肌肉组织，加入3~10倍体积的提取缓冲液，匀浆，离心；取上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度不超过10%，同时加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液至溶液中使溶液中离子强度为1~10 mol/L ，调节溶液pH值为9~11；所述提取缓冲液为乙腈与pH 3.0 McIlvaine 缓冲液体积比6：4的混合液；

（2）吸附：加入适量C₁₈磁球，混匀，充分吸附，磁场分离磁球，弃去上清；所述C₁₈磁球是粒径为70~300 nm，球体内含多个四氧化三铁纳米颗粒，四氧化三铁纳米颗粒被由苯乙烯，丙烯酸等含双键的有机化合物单体聚合而成的有机聚合物或二氧化硅包裹呈球形，磁性微球的外表面上修饰有完全疏水性的C₁₈烷烃链基团，磁球含铁量为40~70%的磁性微球；

（3）洗脱、收集：加适量洗脱液将磁球上的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫洗脱，磁力架分离磁球，收集洗脱液。

2.根据权利要求1所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于：步骤（1）中提取获得的上清液加入超纯水或NaCl溶液稀释至乙腈浓度为2%~10%，加入可溶性无机盐或可溶性无机盐溶液至溶液中使溶液中离子强度为1~10 mol/L。

3.根据权利要求1所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于步骤（3）洗脱液为纯乙腈。

4.权利要求3所述的富集方法在隐色孔雀石绿和隐色结晶紫分析检测中的应用，其特征在于：收集洗脱液，过滤，直接进样进行液相色谱或液相色谱-质谱联用定量分析。

5.根据权利要求1~3任一所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于所述C₁₈微球按照如下步骤制备：

以羧基化聚苯乙烯磁性微球为原料：

1）羧基化磁球的氨基化：将相应粒径的表面羧基修饰的商品化聚苯乙烯磁球分散于pH4-5硼酸盐缓冲液中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和 N-羟基硫代琥珀酰亚胺以活泼酯法活化磁球上的羧基；取乙二胺，加入剂量为羧基摩尔数的300~800倍，用浓盐酸调节pH到8~9后加入活化后的磁球，常温振荡反应10~12h，得表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球；

2）油酸上羧基的活化：按体积比1:5~1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8~9；

3）用油酸功能化聚苯乙烯磁球：将粒径为70~300 nm、表面氨基修饰的聚苯乙烯磁球用无水四氢呋喃洗涤后，按6~12 g/mL的比例加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，保存备用。

6.根据权利要求1~3任一所述的富集水产品中隐色孔雀石绿以及隐色结晶紫的方法，其特征在于所述C₁₈微球按照如下步骤制备：

以外壳为二氧化硅粒径范围在70-300 nm之间的磁球为原料：

化学共沉淀法合成超顺磁性Fe₃O₄纳米单颗粒，再将Fe₃O₄纳米单颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后氮气吹干；2.0 mL环己烷悬浮3g Fe₃O₄纳米颗粒获得磁流体，将磁流体转入400 mL，0.01M含0.2~0.5%的SDS的NaHCO₃溶液中，超声波频率为25KHz ，超声功率为200-300 W条件下继续超声乳化30min，形成细乳液；于70℃下回流12h除去环己烷得到Fe₃O₄纳米粒子簇；磁分离Fe₃O₄纳米粒子簇，用浓度 0.9 g/L Tween-80 溶液悬浮Fe₃O₄纳米粒子簇并静置；将上述悬浮液加入200 mL由乙醇50份、25%氢氧化铵溶液 1.5份、H₂O 1.0份 、正硅酯乙酯0.3份配比而成的反应液中反应15~30 min，即可得到内含超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒，外壳为二氧化硅的磁球； 

 2）二氧化硅磁球表面的氨基化： 取粒径为70~300 nm二氧化硅磁球按25~100 g/L比例分散于体积比为2:3~3:2的二甲基甲酰胺/甲苯溶剂中，按1 mg二氧化硅磁珠加1~2 μL的量逐滴加入乙氧基硅烷；氩气保护下室温振荡充分反应，分离磁球，无水乙醇洗涤磁球数次获得氨基表面修饰的二氧化硅磁球；

3）油酸上羧基的活化：按体积比1:5~1:50将油酸加入无水四氢呋喃中，用N,N-二环己基碳二亚胺和:N-羟基琥珀酰亚胺以活泼酯法活化油酸上的羧基，向活化产物中加入三乙胺调节溶液pH值至8~9；

4）用油酸功能化二氧化硅磁球：将表面氨基修饰的二氧化硅磁球按照6~12 g/mL加入已活化羧基的油酸中，剧烈振荡充分反应；分离磁球，分离后的磁球采用无水乙醇洗涤除去多余油酸，最后将获得的C₁₈磁球重悬于无水乙醇中，保存备用。