[发明专利]小鼠胎肝细胞PL08及其建立方法和在成熟红细胞保存中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及利用一种新细胞系，特别是小鼠胎肝细胞PL08[保藏日期：2012年8月3日、保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）、保藏编号：C201297]及其建立方法和应用。 

背景技术

成分输血技术在现代医学中广泛应用，红细胞保存的研究在临床医学中有巨大应用价值。红细胞保存的质量及保存期的长短已成为衡量一个国家临床输血水平的一个重要指标。目前红细胞的保存方法主要有液体保存法、冰冻保存法和冰冻干燥保存法。其中液体法一般指的是4℃低温保存法，冰冻保存指-80℃或-196℃深低温保存。常温条件下保存红细胞还是目前临床应用中的一个空白。 

发明内容

本发明的目的为：提供一种新的小鼠胎肝细胞系PL08及其建立方法，以及该细胞系在体外常温保存成熟人体红细胞中的应用。 

技术方案为：使用PL08细胞系作为基质细胞，与成熟人体红细胞共培养。 

PL08细胞系是发明人建立的一株小鼠胎肝细胞系。其建立的过程如下： 

取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用带有27G针头的无菌注射器反复吹打，以使组织解离，分散为单个细胞。用红细胞裂解液去除红细胞后，将细胞培养在0.1％明胶包被过的细胞培养板上，培养基成分为：aMEM培养基，添加15％的胎牛血清。经过4到5天的培养，去除上清，将贴壁细胞用0.05％的胰酶消化下来，常规方法扩大培养、传代，每次传代过程中保留30％的原培养液，添加70％的新鲜培养液。在本实验室，PL08细胞系已经稳定传代60代以上，培养时间超过1年，细胞大小均一，生长速度稳定。 

PL08细胞系为亚三倍体核型，染色体条数为58-62条（见图1）。该细胞系在添加10％胎牛血清的aMEM培养基中生长良好，接种后1至2天的细胞群体倍增时间为22.4小时，最适生长温度为37摄氏度，最适生长PH值为7.2。 

经反复实验证实，PL08细胞系可以很好的维持成熟人体红细胞的活性，在体外常温保存成熟人体红细胞中有巨大的应用价值。 

附图说明

图1为该细胞系124代核型分析图像。 

图2是培养细胞显微图像。 

图3是脐带血在37摄氏度，5％CO₂的培养条件下和与PL08共培养条件下培养12天，细胞形态比较示意图。 

图4是脐带血在在37摄氏度，5％CO₂的培养条件下培养18天，细胞形态比较示意图。 

小鼠胎肝细胞PL08保藏日期：2012年8月3日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏编号：C201297；保藏地址：中国.武汉.武汉大学。 

具体实施方式

下述实施例中，所用试剂材料及其来源包括： 

PL08细胞系由发明人构建，脐带血由广州脐带血干细胞库提供。流式抗体GPA/CD71为eBioscience产品，StemSpan无血清培养基为STEMCELL公司产品，细胞因子human Insulin-like growth factor(hIGF)、Human Erythropoietin(hEPO)、human stem cell factor(hSCF)、human interleukin 3(hIL3)为PeproTech公司产品，Lipids和Dexametasone为Sigma-Aldrich公司产品，细胞培养板为Corning Costar公司产品。 

实施例1  PL08作为基质细胞与脐带血细胞共培养实验 

脐带血解冻后，重悬于10ml PBS缓冲液中，对分离到的细胞进行计数。将细胞稀释至1X10⁶个/ml，分两组培养。第一组作为对照组，培养在stemspan培养基中，添加的细胞因子及浓度如下：lipids(40ug/ml)，Dexametasone(1um)，hEPO(20ng/ml)，hSCF(100ng/ml)，hlGF1(40ng/ml)，hlL3(10ng/ml)。第二组作为实验组，与PL08基质细胞共培养，培养基及细胞因子成分与第一组相同。 

如图3细胞照片所示，在培养第12天，实验组的细胞（图3B）状态良好，同时可见生长状态良好的成熟红细胞（红色箭头所示）；对照组（图3A）有大量细胞发黑变暗，显示正在凋亡。 

如图4，在培养第18天，实验组（图4B）仍然可看到状态良好的成熟红细胞（红色箭头所示），对照组（图4A）则发现大量细胞正在裂解、死亡。