[发明专利]一种海水中重金属镉污染的生物学灵敏检测方法

权利要求书

1.一种用于监测海水中重金属镉污染的热休克蛋白HSP-70实时荧光定量PCR反应的特异性引物，其特征在于：

上游引物为：HSP-70-RT-F：5'-CTGCTTACTTCAACGACTCCC-3'；

下游引物为：HSP-70-RT-R：5'-CTTTTTGTCAAGACCATAGGC-3'；

作为内参基因的青蛤β-actin基因特异性上下游引物为：

β-actin-S：5'-CACCACAACTGCCGAGAG-3'；

β-actin-A：5'-CCGATAGTGATGACCTGACC-3'。

2.一种采用权利要求1所述特异性PCR引物检测海水中重金属镉的生物学方法，其特征在于按如下步骤进行；

（1）以青蛤作为用于重金属镉污染监测的指示生物样本；

（2）样本总RNA提取与纯化：采用通用的RNA提取方法和纯化方法，从青蛤肝脏提取得到纯化的肝脏总RNA；

（3）cDNA第一链合成：以青蛤肝脏中总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为25μL；

（4）实时荧光PCR检测：以上述合成的cDNA第一链为模板，根据所述的特异性引物和内参引物，进行实时荧光PCR扩增反应，获取各管Ct值（Cycle threshold指每个反应管内的荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）；

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

试剂使用量终浓度SYBR? Premix DimerEraser?（2×）荧光PCR混合物12.5 μl×1PCR Forward Primer（10 μM）正向引物0.75 μl0.3 μM×1PCR Reverse Primer（10 μM）反向引物0.75 μl0.3 μM×1Template（＜100 ng）模板2 μl×2dH₂O 灭菌蒸馏水9 μl Total  Volume 总体积25 μl×3

实时定量荧光PCR扩增参数设置如下；

Hold（初期变性）：Cycle（循环数）：1 

95℃ 30秒 

3 Step PCR（扩增）：Cycle（循环数）：40 

95℃ 5秒 

55℃ 30秒 

72℃ 30秒 

Dissociation；

（5）青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据仪器自动记录的每管Ct值，使用以下公式计算；

HSP70基因相对表达量=2^-△△Ct；

 △Ct=Ct HSP70-Ct β-actin；

△△Ct=(CtHSP70-Ctβ-actin)实验组-(CtHSP70- Ctβ-actin)对照组；

2^-△△Ct计算实验组模板中HSP70基因的量相对于对照组的变化量，取实验均值，即为青蛤肝脏HSP70基因的相对表达量。