[发明专利]用于Marker I的制备质粒的构建方法及用途

权利要求书

1.用于DNA Marker制备的质粒，所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且同一质粒中各DNA Marker片段之间含有不同的酶切位点。

2.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述酶切位点为II型限制性内切酶酶切位点，所述酶切位点选白Xho I、BamH I、Hind III或EcoR I等酶切位点。

3.如权利要求1-2任一所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相同的所述酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小。

4.如权利要求3所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同。

5.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO.1。

6.一种用于DNA Marker制备的质粒的制备方法，包括下列步骤：

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有不同的酶切位点；

(2)制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，在每个DNA Marker片段两端加上一个或两个所述酶切位点，后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同；

(3)将DNA Marker片段依次进行连接后采用第一片段的上游引物利最后一个片段的下游引物进行PCR，从而得到所需要的大片段；

(4)在质粒构建中，外源片段的两端各自带有一个骨架载体中不含有的所述酶切位点；

(5)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，将体外连接好的片段与骨架载体进行连接，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)为：分别以步骤(2)获得的各DNA Marker前体片段为起点，反复利用PCR的方式获得含有各DNA Marker前体片段的片段，直至各DNA Marker前体片段连成一条大片段，然后将此片段连接入步骤(5)的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述各片段两端酶切位点选自II型限制性内切酶酶切位点。所述酶切位点选白Xho I、BamH I、Hind III或EcoR I等酶切位点。

9.如权利要求6-8任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，所述酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小。

10.如权利要求9所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同

11.如权利要求1所述用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于，所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO.1。