[发明专利]一种DNA Marker的制备方法

权利要求书

1.一种DNA Marker的制备方法，其特征在于：在制备过程中采用DNA序列为SEQ ID NO.1和DNA序列为SEQ ID NO.2的两种质粒中的一种和两种。

2.根据权利要求1所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)在制备过程中采用DNA序列为SEQ ID NO.1和DNA序列为SEQ ID NO.2的两种质粒；

(2)将步骤(1)所述两种质粒转入宿主菌后扩增质粒；

(3)分离质粒并采用单酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切获得DNA Marker所需片段，并将两种质粒完全酶切的产物按照2∶1的浓度比例混合，即获得DNA Marker。

3.根据权利要求2所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中宿主菌为大肠杆菌。

4.根据权利要求2所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中限制性内切酶为：DNA序列为SEQ ID NO.1的质粒的限制性内切酶为Xmn I，DNA序列为SEQ ID NO.2的质粒的限制性内切酶BamH I。

5.一种用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于：所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

6.一种如权利要求5所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点；

(2)制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，在每个DNA Marker片段两端加上一个不同于单酶切位点的酶切位点，且同一片段的两端酶切位点不可相同，后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同；

(3)将DNA Marker片段依次进行连接后采用第一片段的上游引物和最后一个片段的下游引物进行PCR，从而得到所需要的大片段，在大片段中含有所述单酶切位点个数为最终得到片段的个数；

(4)在第一个质粒构建中单酶切位点在骨架载体中存在一个，第二个质粒构建中单酶切位点不存在于骨架载体中；

(5)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，将体外连接好的片段与骨架载体进行连接，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

7.根据权利要求6所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)具体步骤为：

分别以步骤(2)获得的各DNA Marker前体片段为起点，反复利用PCR的方式获得含有各DNA Marker前体片段的片段，直至各DNA Marker前体片段连成一条大片段，然后将此片段连接入步骤(5)的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

8.根据权利要求6所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述各片段两端酶切位点及单酶切位点选自II型限制性内切酶酶切位点。

9.根据权利要求8所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述单酶切位点选自Xmn I、BamH I、Hind III或EcoR I。

10.根据权利要求6-9任一项权利要求所述的用于DNAMarker制备的质粒的构建方法，其特征在于：步骤(1)设计的目标质粒中，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小；

各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同于所述单酶切位点的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同。