[发明专利]芝麻栽培种与Sesamum radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法

权利要求书

1.检测芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的的SSR引物，包括：

引物对HS209

正向引物序列：5’-GCAAGAAGCCGACATGTTTA-3’（Tm=53.35℃）

反向引物序列：5’-ACTCCAATTCCTCCACCAAG-3’（Tm=55.4℃）。

2.一种如权利要求1所述的引物用于芝麻栽培种与Sesame radiatum野生种远缘杂交后代的分子鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）挑选饱满健康的芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）与野生种（Sesame radiatum,2n=64）种子，6月播种后于7月下旬植株进入花期，进行人工授粉杂交，采用组织培养方法对杂交后代幼胚进行培养，获得远缘杂交F₁后代；

（2）提取步骤（1）中芝麻栽培种（Sesame indicum L.,2n=26）、野生种（Sesame radiatum,2n=64）及杂交后代F₁基因组DNA，作为模板备用；

（3）将步骤（2）提取的DNA模板应用于PCR反应体系，运行PCR扩增程序，在引物对HS209的引导下，得到PCR反应产物；

（4）将步骤（3）的PCR反应产物进行凝胶电泳检测，检测结果有栽培种特异性条带210bp和野生种特异性条带200bp、230bp的为真杂种；其余则为假杂种。

3.根据权利要求2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的基因组DNA的提取方法：取植株叶片，加入预冷的提取缓冲液，研磨，4℃离心，弃上清，于沉淀中加入预热的裂解缓冲液，65℃水浴，加入氯仿/异戊醇混合液，混匀，15℃离心，取上清，加预冷的异丙醇，混匀，静置，离心，弃上清，于沉淀中加入乙醇洗涤，离心，倒掉上清后干燥，加TE缓冲液，4℃溶解DNA30min以上，于20℃保存备用。

4.根据权利要求3所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的提取缓冲液包括：0.35MGlucose，0.1M Tris-HCl，5mM Na-EDTA，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水。

5.根据权利要求3所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的裂解缓冲液包括：1.4MNaCl，0.1M Tris-HCl，20mM Na-EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%(V/V)β-Me，余量为无菌超纯水。

6.根据权利要求3所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的TE缓冲液包括：10mMTris-HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，余量为无菌超纯水。

7.根据权利要求2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为：DNA模版50ng，10×Buffer 1μL，10mmol·L^-1dNTPs 0.2μL，10μg·L^-1引物对HS2091μL，2.5U·μL^-1Taq DNApolymerase 0.5μL，加入无菌超纯水至终体积10μL。

8.根据权利要求2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序为：94℃变性3min，94℃变性l min，58℃退火45s，72℃延伸60s，30个循环，72℃总延伸10min；4℃保存。

9.根据权利要求2所述的分子鉴定方法，其特征在于，凝胶电泳检测为：聚丙烯酰胺凝胶浓度为10%，电泳缓冲液为1×TBE，150V恒压电泳2小时，电泳结束后，凝固定先胶，再银染，漂洗，显色，漂洗凝胶后记录读取数据。