[发明专利]一种鉴定瓠瓜类型砧木品种真实性的方法

说明书

一、技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及甬砧系列瓠瓜类型砧木品种‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’真实性的一种鉴定方法。 

二、背景技术

西瓜枯萎病引发连作障碍，在瓜类种植区普遍发生，是瓜类生产的重大难题。据统计，每年西瓜枯萎病的发病率可达10-30％，严重地块甚至绝产，造成巨大经济损失。目前，由于土地资源限制和枯萎病病原菌的顽固性，轮作和化学防治效果不佳，且存在环境污染和食品安全等问题，因此，嫁接是西瓜生产中用以克服连作障碍和枯萎病的有效手段。 

甬砧系列是宁波市农业科学研究院重点针对西瓜嫁接栽培，自主育成的一系列瓠瓜类型砧木品种。它主要包括甬砧1号(早熟栽培西瓜嫁接专用砧木)、甬砧3号(长季节栽培西瓜嫁接专用砧木)、甬砧4号(耐温度逆境西瓜嫁接专用砧木)，和甬砧5号(小果型西瓜嫁接专用砧木)。该系列抗性强、嫁接性能好、对西瓜品质无不良影响、产量高，瓜农增益明显。 

随着甬砧系列的推广，鉴别品种真实性对维护生产者和育种者的利益日益重要。然而，目前砧木品种的鉴定多运用种子或植株形态学鉴定等常规方法。这些方法耗时长、易受环境影响、可靠性差，面对品种繁多、外观表型相似、而遗传基础相对狭窄的砧木材料，鉴定真伪难以奏效。 

砧木新品种‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’至今只作了大田形态学纯度鉴定，尚缺乏便捷有效的品种真实性鉴定方法，对于品种保护还远远不够。 

三、发明内容

针对上述问题，本发明提供一种利用DNA指纹图谱鉴定甬砧系列瓠瓜类型砧木品种‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’品种真实性的方法。 

为实现本发明的目的，发明者提供以下技术方案：采用CTAB法提取‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’和‘甬砧5号’及其对照品种的幼叶DNA；利用4个RAPD引物和3对SSR引物进行PCR扩增(引物名称与序列表中序列号的对应关系如表1所示，引物具体序列见本说明书最后一页所附序列表)；扩增产物经琼脂糖电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。有差异的等位位点，扩增出条带的记为“1”，同一位置无带记为“0”；将这些差异扩增片段转换为由1和0组成的字符串，即构成DNA指纹图谱，用以区分4份瓠瓜类型砧木品种及其对照。 

本发明的优点：与常规形态鉴定比较，本发明的鉴定结果准确可靠、耗时短、不受环境影响、操作简单，可以同时鉴定多个品种，方便快捷。 

四、附图说明

图1为本发明实施例中，RAPD引物s23、s24、s148、s255(左)和SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128(右)在‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧1号’中的扩增。 

图1中左侧四幅图片自上而下分别是RAPD引物s23、s24、s148、s255在‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧1号’中的扩增；右侧三幅图片自上而下分别是SSR引物S1001/1002、S1109/1110、S1127/1128在‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照材料‘神通力’和‘京欣砧1号’中的扩增。两组图片样品排列顺序自左至右依次为DNA Marker、‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’、‘神通力’和‘京欣砧1号’。图片左侧标注是DNA marker标准 分子量，右侧标注是引物名称及差异位点所在片段大小。 

五、具体实施方式

1、取样：播种‘甬砧1号’、‘甬砧3号’、‘甬砧4号’、‘甬砧5号’及其对照，待植株长至5-6片真叶时，采集嫩叶1g，-80℃保存。 

2、DNA提取：参照CTAB法(见：Murray HG，Thompson WF.Rapid isolation of higher weight DNA.Nucleic Acids Res，1980，8：4321)，提取新鲜叶片总基因组DNA。