[发明专利]一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞

说明书

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆胚的核供体细胞的构建，特别涉及一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞。

背景技术

Myostatin是骨骼肌生长发育的负调控因子，Myostatin基因（MSTN gene）的自然突变使肉牛、猪、绵羊等动物的骨骼肌呈现过度发育的双肌表型。Myostatin敲除的小鼠其肌肉量是野生型小鼠的2-3倍(McPherron,Lawler,.et al.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-βsuperfamily member[J].Nature,1997,387:83-90.)，因此，可以通过Myostatin基因失活的方法来生产具有高产肉性状的转基因家畜。现有的失活方法包括以下几种：

1）Myostatin基因的缺失或变异

通过使Myostatin缺失或变异可以使动物体的肌肉大量生长。McPherron等(McPherron,Lawler,.et al.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-βsuperfamily member[J].Nature,1997,387:83-90.)报道肌抑素敲除鼠在青年期(2～5月龄)的肌肉量大约提高了30%，并且纯合子鼠的增重几乎全部为肌纤维的增生和肥大。McPherron等(McPherron AC,Lee SJ.1997.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene.Proc Natl Acad Sci U S A 94:12457-12461.)发现肌抑素缺失突变对鼠肌肉量影响较牛明显。张蕾（Zhang,L.,Yang,X.,An,X.,Chen,Y.,2007.Myostatin gene targeting in cultured China Han ovine myoblast cells.Animal 1,1401-1408）等通过基因打靶的方法对绵羊骨骼肌细胞的Myostatin基因进行的敲除，发现阳性细胞的Myostatin蛋白表达量较阴性对照明显降低。Myostatin缺失变异可提高肌肉量并改善饲料利用效率，野生型的Myostatin前肽在体内是异变的，当注射它在BMP-1/TLD家族的金属蛋白酶的切割位点的突变体到正常小鼠或杂合子小鼠时其在增加肌肉量上有很强的作用(Bogdanovich V， Pogrebniak SG.2009.[Analysis of non-specific immunity status in children using basic statistic].Lik Sprava:92-97.Wolfman NM,McPherron AC,Pappano WN,Davies MV，Song K,Tomkinson KN,Wright JF,Zhao L,Sebald SM,Greenspan DS,Lee SJ.2003.Activation of latent myostatin by the BMP-1/tolloid family of metalloproteinases.Proc Natl Acad Sci U S A 100:15842-15846.)。

2）肌肉生长抑制素抗体