[发明专利]一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种植生拉乌尔菌及其生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。

背景技术

香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香兰醛等，是香荚兰豆中的主要成分，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子量为152.15。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。

香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”，广泛应用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。香兰素的世界年消费量约1.2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。

目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法和化学合成法。香兰素在香荚兰豆中含量约为15~20g/kg。香荚兰种植受地域和气候环境的限制产量极少，且在种植过程中需要对花朵进行人工授粉、劳动强度大，难以进行大规模栽种，远远不能满足市场的需求。目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。

生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用微生物（微生物的生长细胞、微生物的休止细胞）、酶（来自微生物或动植物的纯酶或粗酶）或植物细胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。可接受大量的外源复杂分子作为底物，化学选择性、区域选择性、立体选择性或对映选择性的催化底物生成相应的产物。用生物转化法生产的香兰素与植物提取的天然香兰素等同（Natural-identical vanillin），被称为生物香兰素（Bilogic Vanillin）。许多天然物质如阿魏酸、1,2-二苯乙烯酚、丁香酚、木质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质。利用微生物发酵的方法，模拟酶在香荚兰中讲解阿魏酸衍生物时产生香兰素的过程而得的“natural vanillin”，符合EU和FDA对天然香精的使用安全要求。

关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道，培养基成分较为复杂，生产成本较高，副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等，给产品分离提取带来了相当的困难。经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一株植生拉乌尔菌及用此植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸来生产天然香兰素的方法。

本发明提供一种植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005的生物学特征是：革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长，

所述植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为：其16SrRNA序列全长1408bp，16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563%。

本发明提供一种利用植生拉乌尔菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，其步骤如下：

1）菌种活化：取植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4 CCTCC M 2012005接种到斜面培养基上，在25~38℃条件下，静置培养24~72h后得到活化菌种；

2）制备种子培养液：将步骤1）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25~38℃条件下，100~150rpm/min振荡培养24h~72h，连续转接1~3次，制得种子培养液；

3）发酵：将步骤2）中所得的种子培养液，按体积百分比2~20%的接种量接入发酵培养基，在32~40℃条件下，100~200rpm/min振荡培养24~72h；